Longitudinal en Imágenes Vivos y Cuantificación del Injerto de Islotes Pancreáticos Humanos y Células Huésped Contribuyentes en la Cámara Ocular Anterior
Summary
El objetivo de este protocolo es monitorear continuamente la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos y el huésped contribuyente frente a las células del donante. Esto se logra trasplantando islotes humanos en la cámara anterior del ojo (ACE) de un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-receptor del ratón seguido de imágenes repetidas de 2 fotones.
Abstract
La toma de imágenes de células beta es un paso clave hacia la comprensión del trasplante de islotes. Aunque se han desarrollado y utilizado in vivodiferentes plataformas de imágenes para el registro de la biología de células beta, están limitadas en términos de permitir la resolución de una sola célula y grabaciones longitudinales continuas. Debido a la transparencia de la córnea, la cámara anterior del ojo (ACE) en ratones es muy adecuada para estudiar la biología celular de los islotes pancreáticos humanos y de ratón. Aquí está una descripción de cómo este enfoque se puede utilizar para realizar grabaciones longitudinales continuas de injerto y revascularización de injertos de islotes humanos individuales. Los injertos de islotes humanos se insertan en el ACE, utilizando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-ratones como receptores. Esto permite la investigación de la expansión de las células receptoras frente a las de los donantes y la contribución de las células receptoras en la promoción de la encapsulación y vascularización del injerto. Además, se describe un enfoque paso a paso para el análisis de imágenes y la cuantificación del volumen de los islotes o de la vasculatura segmentada y de las células receptoras que forman cápsulas de islotes.
Introduction
La diabetes mellitus describe un grupo de enfermedades metabólicas caracterizadas por niveles elevados de glucosa en sangre como resultado de la producción insuficiente de insulina por pérdida o disfunción de las células beta de islotes pancreáticos, a menudo acompañadas de resistencia a la insulina. La diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D) son enfermedades complejas en las que la disfunción progresiva de las células beta causa el desarrollo de la enfermedad. T1D se precipita por un ataque autoinmune en las células beta, mientras que T2D se considera impulsado por factores metabólicos, aunque con evidencia creciente de inflamación sistémica de bajo grado1. El trasplante de islotes humanos donantes, particularmente a pacientes con T1D, ofrece la posibilidad de proporcionar control glucémico fisiológico. Sin embargo, la escasez de donantes de tejidos y el injerto deficiente de islotes han evitado que el trasplante de islotes se convierta en una opción terapéutica principal. Una proporción sustancial del injerto de islotes funcionales se pierde en el período inmediatamente posttrasplante (24-48 h) debido al entorno huésped hipoxico, inflamatorio e inmunogénico2,,3. Para evaluar la eficiencia de los métodos de intervención para la mejora de la supervivencia de los islotes, es necesario un seguimiento continuo de dichos trasplantes.
Las técnicas in vivo para imaginar y rastrear el destino de los islotes pancreáticos humanos trasplantados después del trasplante siguen siendo un desafío para la investigación de la diabetes4,,5. Hasta la fecha, las técnicas de imagen no invasiva, incluida la tomografía por emisión de positrones (PET), la resonancia magnética (RM) o la ecografía (EE.UU.) muestran un potencial para la cuantificación y evaluación funcional de islotes trasplantados en condiciones experimentales5. Sin embargo, dados los pequeños tamaños de los islotes, las mediciones cuantitativas de esas modalidades son insuficientes. La cámara anterior del ojo (ACE) como lugar de trasplante para la observación es una solución de imagen no invasiva prometedora que ofrece una resolución espacial efectivamente más alta y un monitoreo frecuente durante largos períodos de tiempo6. Este método ha sido explotado con éxito para estudiar la biología de los islotes de ratón (revisado en Yang et al.7), las respuestas inmunitarias autoinmunes8, así como el injerto de islote humano9,10.
Aquí el método de trasplante de ACE se combina con un enfoque de imágenes de 2 fotones para investigar la dinámica del proceso de injerto de islotes pancreáticos humanos mediante grabaciones continuas y repetidas en injertos de islotes individuales hasta 10 meses después del trasplante. Las propiedades de imagen multifotónica de mayores profundidades de imagen y reducción del fotoblancarido general y el daño fotográfico superan las limitaciones de imagen de la microscopía confocal11. La cuantificación de imágenes fluorescentes implica varias etapas, incluyendo la preparación de muestras de islotes, el trasplante de islotes, la adquisición de imágenes, el filtrado de imágenes para eliminar el ruido o el fondo de los islotes, la segmentación, la cuantificación y el análisis de datos. El paso más difícil suele ser particionar o segmentar una imagen en varias partes o regiones. Esto podría implicar la separación de la señal del ruido de fondo, o las regiones de agrupación en clústeres de vóxeles en función de similitudes en el color o la forma para detectar y etiquetar los vóxeles de un volumen 3D que representa la vasculatura de islotes, por ejemplo. Una vez segmentadas, las estadísticas, como los tamaños de volumen de objetos, suelen ser fáciles de extraer. Se proporciona un método para la cuantificación y extracción de los datos de imágenes, como la segmentación y la visualización de datos. Se presta especial atención a la eliminación de la autofluorescencia en los islotes humanos y a la distinción entre la vasculatura del islote y la cápsula de islote que forma células receptoras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un método para estudiar el proceso de injerto de células de islotes pancreáticos humanos observando la participación del tejido receptor y donante. Después de una cirugía mínima invasiva que implanta islotes humanos en la cámara anterior de un ojo de ratón inmunodeficient, el ratón se recupera rápidamente en cuestión de minutos después de la cirugía. El procedimiento se realiza en un ojo. Generalmente, de 5 a 7 días después de la posimplantación en adelante, la córnea está lo suficientement…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación, El área de investigación estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, la Fundación Sueca para la Investigación Estratégica Dnr IRC15-0067 a LUDC-IRC, la Sociedad Fisiográfica Real en Lund, Diabetesf-rbundet y Barndiabetesf-rbundet.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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