Längsgående In Vivo Imaging och kvantifiering av mänskliga pankreas islet ympning och bidragande värdceller i främre ögat kammaren
Summary
Målet med detta protokoll är att kontinuerligt övervaka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen och den bidragande värd kontra givaren celler. Detta åstadkoms genom att mänskliga holmar transplanteras in i ögats främre kammare (ACE) hos en NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-musmottagare följt av upprepad 2-fotonavbildning.
Abstract
Imaging betaceller är ett viktigt steg mot förståelse av holme transplantation. Även om olika bildåtergivning plattformar för inspelning av beta cellbiologi har utvecklats och utnyttjas in vivo, de är begränsade när det gäller att tillåta encellsupplösning och kontinuerlig longitudinella inspelningar. På grund av öhinnans transparens är ögats främre kammare (ACE) i möss väl lämpad att studera human- och muspanscreatic holme cellbiologi. Här är en beskrivning av hur detta tillvägagångssätt kan användas för att utföra kontinuerliga longitudinella inspelningar av ympning och revascularization av enskilda mänskliga holme ympkvistar. Mänskliga holme ympkvistar sätts in i ACE, med hjälp av NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4–Rag2-/-möss som mottagare. Detta möjliggör för undersökningen av expansionen av mottagaren kontra givare celler och bidraget från mottagarceller i att främja inkapsling och vaskularisering av transplantatet. Vidare beskrivs en stegvis metod för bildanalys och kvantifiering av holmevolymen eller segmenterad vasculature- och holmekapsel som bildar mottagarceller.
Introduction
Diabetes mellitus beskriver en grupp av metabola sjukdomar som kännetecknas av förhöjda nivåer av blodglukos som resultat av otillräcklig insulinproduktion från förlust eller dysfunktion av bukspottskörteln holme betaceller, ofta åtföljs av insulinresistens. Typ 1 (T1D) och typ 2-diabetes (T2D) är komplexa sjukdomar där betacellernas progressiva dysfunktion orsakar sjukdomsutveckling. T1D fälls ut av en autoimmun attack på betacellerna, medan T2D anses vara driven av metabola faktorer, om än med ökande bevis på låggradig systemisk inflammation1. Transplantation av givaren mänskliga holmar, särskilt till T1D patienter, erbjuder potential för att ge fysiologiska glykemisk kontroll. Men, en brist på vävnad givare och dålig holme engraftment har förhindrat holme transplantation att bli en mainstream terapeutiska alternativ. En väsentlig andel av det funktionella holmetransplantatet går förlorat under den omedelbara posttransplantationsperioden (24–48 h) på grund av den hypoxiska, inflammatoriska, immunogena värdmiljön2,3. För att utvärdera effektiviteten av interventionsmetoder för förbättring av holmeöverlevnad är kontinuerlig övervakning av sådana transplantationer nödvändig.
In vivo tekniker för att bilden och spåra ödet för transplanterade mänskliga bukspottskörteln holmar efter transplantation fortfarande en utmaning för diabetes forskning4,5. Hittills visar noninvasive imaging tekniker, inklusive positron emissions tomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRI), eller ultraljud (US) potential för kvantifiering och funktionell utvärdering av transplanterade holmar i experimentella förhållanden5. Med tanke på de små storlekarna i skäret lider dock kvantitativa mätningar av dessa modaliteter av otillräcklig upplösning. Ögats främre kammare (ACE) som transplantationsplats för observation är en lovande noninvasiv avbildningslösning som erbjuder effektivt högre rumslig upplösning och frekvent övervakning under långa tidsperioder6. Denna metod har framgångsrikt utnyttjats för att studera mus holme biologi (granskas i Yang et al.7), autoimmuna immunsvar8, samt mänskliga holme ympning9,10.
Här ACE transplantation metoden kombineras med en 2-foton bildframställning strategi för att undersöka dynamiken i den mänskliga bukspottskörteln holme engraftment processen genom kontinuerliga och upprepade inspelningar på enskilda holme ympkvistar i upp till 10 månader efter transplantation. Multiphoton imaging egenskaper större bildframställning djup och minskad övergripande fotobleaching och fotoskador övervinna bildframställning begränsningar konfokalmikroskopi11. Kvantifiering av fluorescerande avbildning innebär flera steg, inklusive holme prov beredning, holme transplantation, bild förvärv, bild filtrering för att ta bort holme buller eller bakgrund, segmentering, kvantifiering och dataanalys. Det mest utmanande steget är vanligtvis partitionering eller segmentering av en bild i flera delar eller regioner. Detta kan innebära att separera signal från bakgrundsljud, eller klustring regioner av voxels baserat på likheter i färg eller form för att upptäcka och märka voxels av en 3D-volym som representerar holme vaskula, till exempel. När den har segmenterats är statistik som objektvolymstorlekar vanligtvis okomplicerad att extrahera. Förutsatt är en metod för kvantifiering och extrahering av bildframställning data, såsom segmentering och datavisualisering. Särskild uppmärksamhet ägnas åt avlägsnandet av autofluorescens i mänskliga holmar och åtskillnad mellan holme vasculature och holme kapsel bildar mottagarceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
En metod presenteras för att studera den mänskliga bukspottskörteln holme cell ympning processen genom att observera medverkan av mottagare och givare vävnad. Efter en minimal invasiv kirurgi implantera mänskliga holmar i främre kammaren av en immunodeficient mus öga, musen återhämtar sig snabbt inom några minuter efter operationen. Proceduren utförs på ett öga. Generellt, från 5 – 7 dagar postimplantation och framåt hornhinnan är tillräckligt läkt för att utföra intravital bildbehandling.
<p cl…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har fått stöd av Vetenskapsrådet, Strategiska forskningsområdet Exodiab, Dnr 2009-1039, Stiftelsen för Strategisk Forskning Dnr IRC15-0067 till LUDC-IRC, Kungliga Fysiografiska Sällskapet i Lund, Diabetes och Barndiabetförbundetes.
Materials
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
