लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) एक आइसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण (iNAAT) है जिसने रोगजनक पहचान क्षेत्र में व्यापक रुचि को आकर्षित किया है। यहां, हम पशु भोजन में साल्मोनेला स्क्रीनिंग और संस्कृति अलगाव से प्रकल्पित साल्मोनेला की पुष्टि के लिए एक त्वरित, विश्वसनीय और मजबूत विधि के रूप में एक बहु-प्रयोगशाला-मान्य साल्मोनेला लैंप प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) कई बैक्टीरियल, फंगल, परजीवी और वायरल एजेंटों की तेजी से पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण के रूप में उभरा है। साल्मोनेला दुनिया भर में खाद्य सुरक्षा चिंता का एक जीवाणु रोगजनक है, जिसमें जानवरों के लिए भोजन शामिल है । यहां प्रस्तुत एक बहु प्रयोगशाला-मान्य साल्मोनेला लैंप प्रोटोकॉल है जिसका उपयोग साल्मोनेला संदूषण की उपस्थिति के लिए पशु भोजन को तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है और इसका उपयोग सभी खाद्य श्रेणियों से बरामद संभावित साल्मोनेला आइसोलेट की पुष्टि करने के लिए भी किया जा सकता है। लैंप परख विशेष रूप से साल्मोनेला आक्रमण जीन(invA)को लक्षित करता है और तेजी से, संवेदनशील और अत्यधिक विशिष्ट है। टेम्पलेट डीएनए पशु भोजन या प्रकल्पित साल्मोनेला आइसोलेट्स की शुद्ध संस्कृतियों के संवर्धन शोरबा से तैयार किए जाते हैं। लैंप रिएजेंट मिश्रण एक आइसोथर्मल मास्टर मिक्स, प्राइमर, डीएनए टेम्पलेट और पानी के संयोजन से तैयार किया जाता है। लैंप परख 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर चलता है। वास्तविक समय फ्लोरेसेंस के माध्यम से सकारात्मक परिणामों की निगरानी की जाती है और 5 मिनट के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है। लैंप परख पशु भोजन या संस्कृति माध्यम में अवरोधकों के लिए उच्च सहिष्णुता प्रदर्शित करता है, जो स्क्रीनिंग और साल्मोनेलाकी पुष्टि के लिए एक तेजी से, विश्वसनीय, मजबूत, लागत प्रभावी और उपयोगकर्ता के अनुकूल विधि के रूप में कार्य करता है। लैंप विधि हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन के जीवाणु विश्लेषणात्मक मैनुअल (BAM) अध्याय 5 में शामिल किया गया है ।
लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) जापानीवैज्ञानिकोंके एक समूह द्वारा 2000 में आविष्कार किया गया एक उपन्यास इसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण (iNAAT) है। प्रारंभिक चरणों के दौरान एक लक्ष्य-विशिष्ट स्टेम-लूप डीएनए संरचना के गठन के माध्यम से, लैंप इस शुरुआती सामग्री अर्ध-तेजी से बढ़ाने के लिए एक स्ट्रैंड-विस्थापित डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप 1 घंटे1 से कम समय में लक्ष्य की 109प्रतियां होती हैं। पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) की तुलना में, एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एनएएट, लैंप के पास कई फायदे हैं। सबसे पहले, लैंप प्रतिक्रियाएं आइसोथर्मल परिस्थितियों में की जाती हैं। यह एक परिष्कृत थर्मल साइकिलिंग उपकरण की आवश्यकता को कम करता है। दूसरा, दीपक संस्कृति मीडिया और जैविक पदार्थों के प्रति अत्यधिक सहिष्णु है2 नैदानिक और खाद्य अनुप्रयोगों दोनों के लिए प्रदर्शन के साथ3,4। यह नमूना तैयार करने को सरल बनाता है और झूठे नकारात्मक परिणामों को कम करता है5. तीसरा, लैंप कई डिटेक्शन प्लेटफार्मों के लिए उत्तरदायी है, जैसे टर्बिडिटी, कोलोरीट्री, बायोल्यूमिनेसेंस, फ्लोरेसेंस, और माइक्रोफ्लुइडिक्स6। चौथा, दीपक अत्यधिक विशिष्ट है क्योंकि यह छह से आठ विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए चार से छह विशेष रूप से डिजाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करता है1,7। पांचवां, लैंप अतिसंवेदनशील है और कई अध्ययनों ने पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर8के प्रति अपनी बेहतर संवेदनशीलता की सूचना दी है । अंत में, लैंप कई परख के साथ तेजी से है अब एक 30 मिनट मानक रन समय अपनाने जबकि पीसीआर प्रकार की परख आमतौर पर 1−2 घंटे8ले ।
इन आकर्षक विशेषताओं ने व्यापक रोगजनक पता लगाने वाले क्षेत्रों में दीपक के अनुप्रयोग को बढ़ावा दिया, जिसमें इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स9,पशु रोग निदान10और खाद्य और पर्यावरण परीक्षण11शामिल हैं। विशेष रूप से, डब्ल्यूएचओ द्वारा परिधीय सेटिंग्स12में पल्मोनरी तपेदिक निदान के लिए थूक-धब्बा माइक्रोस्कोपी के लिए एक वैध प्रतिस्थापन परीक्षण के रूप में डब्ल्यूएचओ द्वारा टीबी-लैंप (माइकोबैक्टीरियम तपेदिकके लिए लैंप) की सिफारिश की गई है । लैंप एप्लिकेशन एलर्जी, पशु प्रजातियों, दवा प्रतिरोध, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों और कीटनाशकों का पता लगाने के लिए माइक्रोबियल पहचान से परे भीफैलताहै।
नॉनटीफोइडल साल्मोनेला दुनिया भर में पर्याप्त खाद्य सुरक्षा और सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का एक जूनोटिक रोगजनक है14. इसे जानवरों के लिए भोजन (यानी पशु भोजन)15, 16में एक महत्वपूर्ण माइक्रोबियल खतरे के रूप में भीपहचानागया है । दूषित मानव भोजन और पशु भोजन से साल्मोनेला बीमारियों/प्रकोपों को रोकने के लिए, विभिन्न प्रकार के मैट्रिस में साल्मोनेला के परीक्षण के लिए तेजी से, विश्वसनीय और मजबूत तरीके होना अनिवार्य है । पिछले एक दशक में, खाद्य मैट्रिस की एक विस्तृत श्रृंखला में साल्मोनेला लैंप का परख के विकास और अनुप्रयोग पर अंतरराष्ट्रीय स्तर पर काफी प्रयास किए गए हैं, जैसा कि हाल ही में एक व्यापक समीक्षा8में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यहां प्रस्तुत किएगए कई साल्मोनेला लैंप काहते हैं, जिन्होंने अच्छी तरह से स्थापित अंतरराष्ट्रीयदिशानिर्देशों 17, 18,19,20के बाद बहु-प्रयोगशाला सत्यापन को सफलतापूर्वक पूरा किया है।
हमारे साल्मोनेला लैंप परख विशेष रूप से साल्मोनेला आक्रमणजीन इनवा (जेनबैंक परिग्रहण संख्या M90846)21 को लक्षित करता है और कई खाद्य मैट्रिस 4,22, 23, 24,25,26में तेजीसे,विश्वसनीय और मजबूत है। इस विधि को छह पशु खाद्य मैट्रिस में एक प्रीकॉलाबोरेटिव अध्ययन26 में और सूखे कुत्ते के भोजन में एक बहु प्रयोगशाला सहयोगात्मक अध्ययन19में मान्य किया गया है । नतीजतन, साल्मोनेला लैंप विधि यहां प्रस्तुत हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के जीवाणु विश्लेषणात्मक मैनुअल (BAM) अध्याय 5 साल्मोनेला27 में शामिल किया गया है दो प्रयोजनों की सेवा के लिए, पशु भोजन में साल्मोनेला की उपस्थिति के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि के रूप में एक और दो संभावित साल्मोनेला सभी खाद्य पदार्थों से अलग के लिए एक विश्वसनीय पुष्टि विधि के रूप में ।
हम यहां स्क्रीनिंग और पशु भोजन और शुद्ध संस्कृति में साल्मोनेला की पुष्टि के लिए एक सरल, तेजी से, विशिष्ट, और संवेदनशील दीपक विधि क्रमशः प्रस्तुत किया है । एक आइसोथर्मल मास्टर मिक्स की सुविधा के साथ जिसमें चार प्रमुख अभिकर्मक होते हैं, और एक रेडी-टू-यूज, इन-हाउस तैयार प्राइमर मिक्स, लैंप रिएक्शन को कोडांतरण करने के लिए केवल कुछ पाइपिंग स्टेप्स(चित्रा 1)की आवश्यकता होती है। प्रवर्धन और एनियल चरणों सहित कुल रन समय 38 मिनट से कम है(चित्रा 2ए, बी और चित्रा 3ए, बी)। वास्तविक समय फ्लोरेसेंस(चित्रा 2 सी और चित्रा 3सी, डी)के माध्यम से सकारात्मक परिणामों की निगरानी की जाती है और 5 मिनट26के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है। एनील चरण लैंप विशिष्टता की अतिरिक्त पुष्टि के रूप में कार्य करता है क्योंकि केवल सही टीएम (लगभग 90 डिग्री सेल्सियस) वाले नमूनों को सकारात्मक(चित्रा 2डी, ई और चित्रा 3ई−जी)के रूप में सूचित किया जाता है। शुद्ध संस्कृति में 1 साल्मोनेला सेल की संवेदनशीलता और < 1 CFU/25 ग्राम पशु भोजन में पहले26सूचित किया गया है ।
चूंकि लैंप काफी प्रभावी है और बड़ी मात्रा में डीएनए 1 उत्पन्न करता है, यह महत्वपूर्ण है कि क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए सर्वोत्तम प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग कियाजाताहै, जिसमें लैंप मास्टर मिश्रण तैयार करने और डीएनए टेम्पलेट्स जोड़ने के लिए क्षेत्रों को शारीरिक रूप से अलग करना, फिल्टर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, दस्ताने अक्सर बदलना, और प्रवर्धन के बाद लैंप प्रतिक्रिया ट्यूब खोलने से परहेज करना शामिल हो सकता है।
इस साल्मोनेला लैंप विधि की विशिष्टता का पहले 300 बैक्टीरियल उपभेदों (185 सेवरों के 247 साल्मोनेला और 53गैर-साल्मोनेला)का उपयोग करके परीक्षण किया गया था और 100% विशिष्ट26होने का प्रदर्शन किया गया था। विशेष रूप से, टीमैक्स में महत्वपूर्ण अंतर दो साल्मोनेला प्रजातियों, एस एंटिका और साल्मोनेला बोंगोरीके बीच और एस एंटिका उपप्रजातियों, विशेष रूप से उपएसपी एरिजोना (IIIa) 26के बीच मनाया गया। बहरहाल, ये अभी भी दीपक परिणामों की व्याख्या के लिए नियमों के अनुसार वैध सकारात्मक परिणाम थे । शुष्क कुत्ते के भोजन में हमारे बहु प्रयोगशाला सहयोगात्मक अध्ययन में 14 विश्लेषकों19शामिल, डुप्लिकेट लैंप रन में असंगत परिणाम वाले नमूनों को कभी-कभार देखा गया । ये आमतौर पर देरी सकारात्मक परिणामों के साथ नमूने शामिल(टीअधिकतम और 15 मिनट) । दोहरा दोनों रन स्वतंत्र रूप से आम तौर पर इस मुद्दे को हल किया । अधिक शायद ही कभी, हम सही टीएम लेकिन कोई या अनियमित टीअधिकतम मूल्यों (< 5 मिनट) के साथ नमूनों का अवलोकन किया । यह आमतौर पर प्रतिक्रिया ट्यूब में हवा के बुलबुले के कारण होता था।
दीपक विधि विकास, मूल्यांकन, पूर्वसंचालक अध्ययन, और बहु प्रयोगशाला सत्यापन के जीवनचक्र के दौरान, हमने विभिन्न पशु भोजन या खाद्य मैट्रिस और संस्कृति मीडिया4,19,22, 23, 24में अवरोधकों के लिए लैंप की उच्च सहिष्णुता देखी है, जो विधि की मजबूती को रेखांकित करता है और वैश्विक स्तर पर कई अन्य अध्ययनों को सहयोग करता है8। यह पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में बेहतर है, जिसे आमतौर पर यह सुनिश्चित करने के लिए आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण की आवश्यकता होती है कि नकारात्मक परिणाम मैट्रिक्स अवरोध28के कारण नहीं हैं। इसके अलावा, लैंप ने 8 अध्ययनों के विशालबहुमतमें पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में समान (या बेहतर) विशिष्टता और संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। लैंप रिएजेंट्स की लागत प्रति प्रतिक्रिया लगभग $ 1 पर है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले लैंप उपकरण छोटे, कम रखरखाव और पोर्टेबल हैं। वे किसी भी आइसोथर्मल प्रवर्धन विधि को संभाल सकते हैं जो फ्लोरेसेंस माप द्वारा लक्ष्य का पता लगाने को नियोजित करता है, दीपक शामिल है। लैंप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, व्यापक रिपोर्ट कई प्रारूप (पीडीएफ, टेक्स्ट और छवि) में उत्पन्न की जा सकती है।
विधि सत्यापन एक महत्वपूर्ण कदम है इससे पहले कि नियमित उपयोग के लिए एक नई विधि अपनाई जा सकती है। यह उल्लेखनीय है कि यहां रिपोर्ट किए गए लैंप प्रोटोकॉल ने बहु-प्रयोगशाला सत्यापन19को सफलतापूर्वक पूरा कर लिया है। अमेरिकी एफडीए के बाम अध्याय 5 साल्मोनेला27में इस लैंप प्रोटोकॉल के हाल ही में शामिल करने के साथ, यह उम्मीद है कि विधि पशु भोजन में एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि के रूप में और सभी खाद्य श्रेणियों से प्रकल्पित साल्मोनेला के लिए एक विश्वसनीय पुष्टि विधि के रूप में बहुत व्यापक उपयोग हासिल करेगी।
The authors have nothing to disclose.
लेखक एफडीए के माइक्रोबायोलॉजी विधिध्यध्य उपसमिति (एमएमवीएस) और बैक्टीरियोलॉजिकल एनालिटिकल मैनुअल (बीएएम) परिषद के सदस्यों को गंभीर रूप से साल्मोनेला लैंप विधि सत्यापन अध्ययन की समीक्षा करने के लिए धन्यवाद देते हैं ।
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |