루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.
루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 수많은 세균성, 곰팡이, 기생및 바이러스 성 제제의 신속한 검출을 위한 강력한 핵산 증폭 시험으로 부상하고 있다. 살모넬라는 동물을 위한 음식을 포함하여 세계적인 음식 안전 관심사의 세균성 병원체입니다. 여기에 제시된 다중 실험실 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜은 살모넬라 오염의 존재를 위해 동물 사료를 신속하게 선별하는 데 사용될 수 있으며 모든 식품 범주에서 회수된 추정 살모넬라 분리를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. LAMP 분석은 특히 살모넬라 침략유전자(invA)를대상으로 하며 신속하고 민감하며 매우 특이적입니다. 템플릿 DNA는 동물 사료의 농축 국물 또는 추정 살모넬라 분리의 순수한 문화에서 제조됩니다. LAMP 시약 혼합물은 이더스 말 마스터 믹스, 프라이머, DNA 템플릿 및 물을 결합하여 제조됩니다. LAMP 분석은 30 분 동안 65 °C의 일정한 온도에서 실행됩니다. 긍정적인 결과는 실시간 형광을 통해 감시되고 5 분 일찍 검출될 수 있습니다. LAMP 분석법은 동물성 식품 또는 배양 배지의 억제제에 대한 높은 내성을 나타내며, 살모넬라를선별하고 확인하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있고 견고하며 비용 효율적이며 사용자 친화적인 방법으로 사용된다. LAMP 방법은 최근 미국 식품의약국의 세균분석 매뉴얼(BAM) 제5장에 통합되었습니다.
루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 일본 과학자1의그룹에 의해 2000년에 발명된 새로운 이더실 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 초기 단계에서 표적 특이적 줄기 루프 DNA 구조의 형성을 통해 LAMP는 가닥 변위 DNA 폴리머라아제를 사용하여 이 시작 물질준기하수수체를 효율적으로 증폭시켜 1h1미만의 표적109카피를 생성한다. 널리 사용되는 NAAT인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 비교하여 LAMP는 몇 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 램프 반응은 이소성 조건하에서 수행됩니다. 이것은 정교한 열 사이클링 장비의 필요성을 없애. 둘째, LAMP는 임상 및 식품 응용 분야3,4모두에 대해 입증된 견고성을 갖춘 배양 매체 및 생물학적 물질2에 매우관대하다. 이렇게 하면 샘플 준비를 단순화하고 잘못된 음수 결과5를최소화합니다. 셋째, LAMP는 탁도, 색도, 생물발광, 형광, 및미세유체6와같은 다중 검출 플랫폼에 순종한다. 넷째, LAMP는 특별히 설계된 프라이머 4~6개에 사용하여 6~8개의 특정 영역1,7을대상으로 하기 때문에 매우 특이적이다. 다섯째, LAMP는 매우 민감하며 수많은 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR8에대한 우수한 민감성을 보고했습니다. 마지막으로, LAMP는 PCR 형 분석이 일반적으로 1-2 h8을취하는 동안 30 분 표준 런타임을 채택하는 많은 분석으로 빠릅니다.
이러한 매력적인 특징은 체외 진단9,동물질환 진단10,식품 및 환경 검사11을포함한 광범위한 병원체 검출 영역에서 LAMP의 적용을 촉진시켰다. 특히, 결핵결핵을 위한결핵(LAMP)은 WHO가 말초 설정에서 폐결핵 진단을 위한 가래-얼룩 현미경검사에 대한 유효한 대체 시험으로서 추천되었다(12) LAMP 응용 프로그램은 또한 알러지 유발 물질, 동물 종, 약물 내성, 유전자 변형 유기체 및 살충제13의검출을 포함하도록 미생물 식별을 넘어 확장됩니다.
nontyphoidal 살모넬라는 전 세계적으로14의실질적인 식품 안전 및 공중 보건 문제의 동물성 병원체입니다. 또한 동물(즉, 동물성 식품)15,16을위한 식품의 중요한 미생물 위험으로 확인되었다. 살모넬라 병/발병이 오염된 인간 음식과 동물 사료로부터 발생하지 않도록 하기 위해 다양한 행렬에서 살모넬라를 테스트하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있으며 강력한 방법을 갖는 것이 필수적입니다. 지난 10 년 동안, 최근 광범위한 검토8에요약된 바와 같이, 다양한 식품 행렬에서 살모넬라 LAMP 에세이의 개발 및 적용에 국제적으로 상당한 노력이 이루어졌습니다. 여기에 제시된 것을 포함하여 몇몇 살모넬라 LAMP 소는,잘 확립된 국제 지침17,18,19,20에따라 다중 실험실 검증을 성공적으로 완료했습니다.
당사의 살모넬라 램프 분석은 특별히 살모넬라 침공 유전자 invA(GenBank 가입 번호 M90846)21을 대상으로 하며, 여러 식품 행렬4,22,23,24,25,26에서빠르고 신뢰할 수 있고 견고하다. 이 방법은 사전 협업 연구26및 다연구소 협력 연구에서 건식 개사료(19)에서6개의 동물사료 행렬에서 검증되었다. 그 결과, 여기에 제시된 살모넬라 램프 방법은 최근 미국 식품의약국(FDA)의 세균성 분석 매뉴얼(BAM) 제5장 살모넬라(27)에 통합되어 동물식품에 살모넬라의 존재에 대한 신속한 검진 방법으로, 2개는 모든 식품에서 분리된 살모넬라를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 사용된다.
동물성 음식과 순수한 문화에서 살모넬라를 선별하고 확인하는 간단하고 신속하고 구체적이며 민감한 LAMP 방법을 소개했습니다. 4개의 키 시약이 포함된 이더스말 마스터 믹스의 편리함과 함께, 기성용, 사내 준비된 프라이머 믹스, LAMP 반응을 조립하려면 몇 개의 파이펫팅단계(도 1)만필요하다. 증폭 및 음막 단계를 포함한 총 실행 시간은 38분 미만입니다(그림2A, B 및 도 3A, B). 양수 결과는 실시간 형광(도2C 및 도 3C,D)을통해 모니터링되며 5분26분으로조기에 검출될 수 있다. 멸음 단계는 정확한 Tm(약 90°C)을 가진 샘플만 양성(도2D, E 및 도 3E−G)으로보고되기 때문에 LAMP 특이성의 추가 확인 역할을 한다. 순수한 배양에서 살모넬라 세포 1개 및 동물사료의 CFU/25 g1의 민감성은 이전에26개에보고되었다.
LAMP는 매우 효과적이며 다량의 DNA1을생성하기 때문에, 최고의 실험실 관행은 가로등 마스터 믹스를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하기 위한 영역을 물리적으로 분리하고, 에어로졸 생성을 피하고, 필터 파이펫 팁을 사용하고, 장갑을 자주 변경하고, 증폭 후 LAMP 반응 튜브를 열지 않도록 하는 것을 포함하는 교차 오염을 방지하는 데 가장 좋은 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다.
본 살모넬라 LAMP 방법의 특이성은 이전에 300개의 세균균종(185개의 세로바르의 살모넬라 247개 및 53개의비살모넬라)을사용하여 시험하고 100% 특이적26인것으로 나타났다. 특히, T맥스의 현저한 차이는 두 살모넬라종, S. 엔테리카와 살모넬라 봉고리,그리고 S. 엔테리카 아종, 특히 아취종(IIIa)26종사이에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들은 여전히 LAMP 결과를 해석하기위한 규칙에 따라 유효한 긍정적 인 결과였다. 14명의분석가19명이참여한 건식 개 사료에 대한 다연구소 협력 연구에서 중복 램프 런에서 일관되지 않은 결과를 갖는 샘플이 때때로 관찰되었습니다. 이들은 일반적으로 지연된 양성 결과를 가진 견본을 관련시켰습니다(Tmax > 15 분). 두 실행 모두 독립적으로 반복하여 일반적으로 문제를 해결했습니다. 더 드물게 정확한Tm을 가진 샘플을 관찰했지만 불규칙한 T최대 값(< 5분)이 없습니다. 이것은 일반적으로 반응 관에 있는 기포에 기인했습니다.
LAMP 방법의 수명주기 전반에 걸쳐 다양한 동물성 식품 또는 식품 매트릭스 및 배양 매체4,19,22,23,24에서램프의 억제제에 대한 높은 관용을 관찰하여, 방법의 견고성을 강조하고 글로벌 스케일8에대한 수많은 다른 연구를 협력하였다. 이는 일반적으로 부정적인 결과가 매트릭스억제(28)로인한 것이 아님을 보장하기 위해 내부 증폭 제어가 필요한 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 우수하다. 또한, LAMP는 대부분의 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 유사한(또는 우수한) 특이성 및민감도를 입증하였다 8. LAMP 시약의 비용은 반응 당 약 $1입니다. 이 프로토콜에 사용되는 LAMP 계측기는 작고 유지 보수가 적으며 휴대용입니다. 그들은 형광 측정, LAMP 포함에 의해 표적 검출을 사용하는 모든 이체 증폭 방법을 처리 할 수 있습니다. LAMP 소프트웨어를 사용하면 포괄적인 보고서를 여러 형식(pdf, 텍스트 및 이미지)으로 생성할 수 있습니다.
메서드 유효성 검사는 일상적인 사용을 위해 새 메서드를 채택하기 전에 중요한 단계입니다. 여기에 보고된 LAMP 프로토콜이 다중 실험실 유효성검사(19)를성공적으로 완료했다는 점은 주목할 만하다. 최근 미국 FDA의 BAM 챕터 5 살모넬라27에이 LAMP 프로토콜이 통합됨에 따라 동물사료의 신속한 선별 방법과 모든 식품 범주에서 분리된 추정 살모넬라 분리를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 훨씬 더 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 살모넬라 LAMP 방법 검증 연구를 비판적으로 검토하기 위한 FDA의 미생물학 방법 검증 소위원회 (MMVS) 및 세균성 분석 매뉴얼 (BAM) 위원회의 회원들에게 감사드립니다.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |