L’amplification isothermale à base de boucle (LAMP) est un test isothermal d’amplification de l’acide nucléique (iNAAT) qui a suscité un grand intérêt dans le domaine de la détection des pathogènes. Ici, nous présentons un protocole Salmonella LAMP validé en laboratoire comme une méthode rapide, fiable et robuste pour le dépistage de Salmonella dans les aliments pour animaux et la confirmation de salmonella présumée de l’isolement culturel.
L’amplification isothermale à médie en boucle (LAMP) est apparue comme un puissant test d’amplification de l’acide nucléique pour la détection rapide de nombreux agents bactériens, fongiques, parasitaires et viraux. Salmonella est un agent pathogène bactérien préoccupant pour la salubrité des aliments dans le monde entier, y compris les aliments pour animaux. Il s’agit d’un protocole Salmonella LAMP validé en laboratoire qui peut être utilisé pour dépister rapidement la présence de salmonelloses chez les animaux et qui peut également être utilisé pour confirmer les isolats présumés de Salmonella récupérés dans toutes les catégories d’aliments. L’analyse LAMP cible spécifiquement le gène d’invasion de Salmonella (invA)et est rapide, sensible et très spécifique. Les DNA modèles sont préparés à partir de bouillons d’enrichissement d’aliments animaux ou de cultures pures d’isolats présumés de Salmonella. Le mélange de réapprovisionnement LAMP est préparé en combinant un mélange maître isothermal, des amorces, un modèle d’ADN et de l’eau. L’analyse LAMP fonctionne à une température constante de 65 °C pendant 30 min. Les résultats positifs sont surveillés par fluorescence en temps réel et peuvent être détectés dès 5 min. L’analyse LAMP présente une tolérance élevée aux inhibiteurs des aliments ou des cultures animales, servant de méthode rapide, fiable, robuste, rentable et conviviale pour le dépistage et la confirmation de Salmonella. La méthode LAMP a récemment été intégrée au chapitre 5 du Manuel d’analyse bactériologique (BAM) de la Food and Drug Administration des États-Unis.
L’amplification isothermale à médiés en boucle (LAMP) est un nouveau test d’amplification de l’acide nucléique isothermique (iNAAT) inventé en 2000 par un groupe de scientifiques japonais1. Grâce à la formation d’une structure d’ADN en boucle de tige spécifique à la cible au cours des étapes initiales, LAMP utilise une polymése d’ADN qui déplace les brins pour amplifier efficacement ce matériau de départ de façon quasi exponentielle, ce qui donne10 9 copies de la cible en moins de 1 h1. Par rapport à la réaction en chaîne de polyméseau (PCR), un NAAT largement utilisé, LAMP possède plusieurs avantages. Tout d’abord, les réactions lamp sont effectuées dans des conditions isothermales. Cela évite la nécessité d’un instrument sophistiqué de cycle thermique. Deuxièmement, LAMP est très tolérant aux médias culturels et aux substancesbiologiques 2 avec une robustesse démontrée pour les applications cliniqueset alimentaires 3,4. Cela simplifie la préparation de l’échantillon et minimise les faux résultats négatifs5. Troisièmement, LAMP est accessible à de multiples plates-formes de détection, telles que la turbidité, la colorimétrie, la bioluminescence, la fluorescence et les microfluidiques6. Quatrièmement, LAMP est très spécifique car il utilise quatre à six amorces spécialement conçues pour cibler six à huit régionsspécifiques 1,7. Cinquièmement, LAMP est ultrasensible et de nombreuses études ont rapporté sa sensibilité supérieure au PCR ou pcr8 en temps réel. Enfin, LAMP est plus rapide avec de nombreux analyses adoptant maintenant un temps de course standard de 30 min tandis que les analyses de type PCR prennent généralement 1−2 h8.
Ces caractéristiques attrayantes ont alimenté l’application de LAMP dans de vastes zones de détection d’agents pathogènes, y compris le diagnostic in vitro9, le diagnostic des maladies animales10et les tests alimentaires etenvironnementaux 11. Notamment, une lampe tuberculeuse (LAMP pour Mycobacterium tuberculosis)a été recommandée par l’OMS comme test de remplacement valide pour la microscopie d’expectorations-frottis pour les diagnostics de tuberculose pulmonaire dans les milieuxpériphériques 12. L’application LAMP s’étend également au-delà de l’identification microbienne pour inclure la détection d’allergènes, d’espèces animales, de résistance aux médicaments, d’organismes génétiquement modifiés et de pesticides13.
Salmonella nontyphoïde est un agent pathogène zoonotique qui a d’importants problèmes de salubrité et de santé publique dans le mondeentier14. Il a également été identifié comme un danger microbien important dans les aliments pour animaux (c.-à-d. aliments pour animaux)15,16. Pour prévenir les maladies ou les éclosions de Salmonella causées par des aliments humains et des aliments pour animaux contaminés, il est impératif d’avoir des méthodes rapides, fiables et robustes pour tester Salmonella dans une variété de matrices. Au cours de la dernière décennie, des efforts considérables ont été déployés à l’échelle internationale pour le développement et l’application d’essais Salmonella LAMP dans un large éventail de matrices alimentaires, comme l’a récemment résumé un examenapprofondi 8. Plusieurs essais salmonella LAMP, y compris celui présenté ici, ont complété avec succès la validation multi-laboratoires suivant des lignes directrices internationales bien établies17,18,19,20.
Notre analyse Salmonella LAMP cible spécifiquement le gène d’invasion salmonella invA (numéro d’adhésion GenBank M90846)21 et est rapide, fiable et robuste dans plusieurs matricesalimentaires 4,22,23,24,25,26. La méthode a été validée dans six matrices d’aliments pour animaux dans une étude précollaborative26 et dans les aliments secs pour chiens dans une étude collaborative multi-laboratoire19. Par conséquent, la méthode Salmonella LAMP présentée ici a récemment été incorporée au Manuel d’analyse bactériologique (BAM) de la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis (BAM) Chapitre5 Salmonella27 à deux fins, l’une comme méthode de dépistage rapide de la présence de Salmonella dans les aliments pour animaux et l’autre comme méthode de confirmation fiable pour salmonella présumée isolée de tous les aliments.
Nous avons présenté ici une méthode LAMP simple, rapide, spécifique et sensible pour le criblage et la confirmation de Salmonella dans les aliments pour animaux et la culture pure, respectivement. Avec la commodité d’un mélange maître isothermal qui contient quatre réamorts clés, et un prêt-à-utiliser, mélange d’apprêt préparé à l’interne, l’assemblage d’une réaction LAMP ne nécessite que quelques étapes pipetting (Figure 1). Le temps de course total, y compris l’amplification et les phases anneales, est inférieur à 38 min(figure 2A, B et figure 3A,B). Les résultats positifs sont surveillés par fluorescence en tempsréel (figure 2C et figure 3C,D)et peuvent être détectés dès 5 min26. La phase anneale sert de confirmation supplémentaire de la spécificité lamp puisque seuls les échantillons avec tm correct (environ 90 °C) sont déclarés positifs(figure 2D, E et figure 3E−G). Des sensibilités de 1 cellule de Salmonella dans la culture pure et et de 1 CFU/25 g dans la nourriture animale ont été rapportées précédemment26.
Comme LAMP est très efficace et génère une grande quantité d’ADN1, ilest essentiel que les meilleures pratiques de laboratoire soient utilisées pour prévenir la contamination croisée, ce qui peut inclure la séparation physique des zones pour la préparation du mélange maître LAMP et l’ajout de modèles d’ADN, en évitant de générer des aérosols, en utilisant des pointes de pipette filtrante, en changeant souvent de gants et en s’abstenant d’ouvrir des tubes de réaction LAMP après amplification.
La spécificité de cette méthode Salmonella LAMP a déjà été testée à l’aide de 300 souches bactériennes (247 Salmonella de 185 serovars et 53 nonSalmonella)et s’est démontrée 100% spécifique26. Notamment, des différences significatives dans tmax ont été observées entre les deux espèces de Salmonella, S. enterica et Salmonella bongori,et parmi la sous-espèce S. enterica, en particulier le sous-général arizonae (IIIa)26. Néanmoins, il s’agissait encore de résultats positifs valides selon les règles d’interprétation des résultats du LAMP. Dans notre étude collaborative multi-laboratoire dans les aliments secs pour chiens qui a impliqué 14analystes 19, des échantillons ayant des résultats incohérents dans les courses lamp en double ont été parfois observés. Ceux-ci impliquaient généralement des échantillons avec des résultats positifsretardés( Tmax > 15 min). Répéter les deux courses indépendamment généralement résolu le problème. Plus rarement, nous avons observé des échantillons avec tm correct, mais pas ou irrégulière tvaleursmax (< 5 min). Ceci a été habituellement provoqué par des bulles d’air dans le tube de réaction.
Tout au long du cycle de vie de l’élaboration, de l’évaluation, de l’étude précollaborative et de la validation multilaborative de la méthode LAMP, nous avons observé une tolérance élevée de LAMP aux inhibiteurs de divers aliments pour animaux ou matrices alimentaires et médias culturels4,19,22,23,24, soulignant la robustesse de la méthode et collaborant à de nombreuses autres études à l’échelle mondiale8. Ceci est supérieur par rapport à PCR ou PCR en temps réel, qui nécessite généralement un contrôle d’amplification interne pour s’assurer que les résultats négatifs ne sont pas dus à l’inhibitionmatricielle 28. De plus, LAMP a démontré une spécificité et une sensibilité similaires (ou supérieures) par rapport au PCR ou au PCR en temps réel dans la grande majorité des études8. Le coût des reagents LAMP est d’environ 1 $ par réaction. Les instruments LAMP utilisés dans ce protocole sont petits, peu d’entretien et portables. Ils peuvent manipuler n’importe quelle méthode isothermale d’amplification qui emploie la détection de cible par mesure de fluorescence, LAMP inclus. À l’aide du logiciel LAMP, des rapports complets peuvent être générés en format multiple (pdf, texte et image).
La validation de la méthode est une étape cruciale avant qu’une nouvelle méthode puisse être adoptée pour une utilisation courante. Il convient de noter que le protocole LAMP rapporté ici a complété avec succès la validation multi-laboratoire19. Avec l’incorporation récente de ce protocole LAMP dans le bam chapitre 5 salmonella27de la FDA des États-Unis, on s’attend à ce que la méthode gagne une utilisation beaucoup plus large, à la fois comme méthode de dépistage rapide dans les aliments pour animaux et comme méthode de confirmation fiable pour les isolats présumés de Salmonella de toutes les catégories d’aliments.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient les membres du Sous-comité de validation des méthodes de microbiologie (MMVS) et du Bacteriological Analytical Manual (BAM) de la FDA d’avoir examiné de façon critique les études de validation de la méthode Salmonella LAMP.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |