Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) является изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), который вызвал широкий интерес в области обнаружения патогенов. Здесь мы представляем мультилабораторно-проверенный протокол Salmonella LAMP как быстрый, надежный и надежный метод скрининга сальмонеллы в пище животных и подтверждения предполагаемой изоляции сальмонеллы от культурной изоляции.
Опосредованное петлей изотермальное усиление (LAMP) стало мощным тестом на усиление нуклеиновой кислоты для быстрого обнаружения многочисленных бактериальных, грибковых, паразитарных и вирусных агентов. Сальмонеллы является бактериальным патогеном во всем мире проблемы безопасности пищевых продуктов, в том числе продуктов питания для животных. Представлено здесь является несколько лабораторных проверенных Salmonella LAMP протокол, который может быть использован для быстрого проверки животных пищи на наличие загрязнения сальмонеллой, а также может быть использован для подтверждения предполагаемого salmonella изолятов, восстановленных из всех категорий продуктов питания. Анализ LAMP специально нацелен на ген нашествия сальмонеллы(invA)и является быстрым, чувствительным и весьма специфическим. Шаблон ДНК готовятся из обогащения бульонов животной пищи или чистой культуры предполагаемых изолятов сальмонеллы. Смесь реагентов LAMP готовится путем объединения изотермальной смеси мастера, грунтовки, шаблона ДНК и воды. Анализ LAMP работает при постоянной температуре 65 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценции в режиме реального времени и могут быть обнаружены уже через 5 минут. Анализ LAMP демонстрирует высокую толерантность к ингибиторам в животных пищевых продуктов или культуры среды, выступающей в качестве быстрого, надежного, надежного, экономически эффективного и удобного метода для скрининга и подтверждения сальмонеллы. Метод LAMP недавно был включен в Бактериологическое аналитическое руководство Управления по пищевым продуктам и лекарственным продуктам США (BAM) Глава 5.
Петля опосредованное изотермальное усиление (LAMP) является новым изотермальным тестом на усиление нуклеиновой кислоты (iNAAT), изобретенным в 2000 году группой японскихученых 1. Путем формирования целевой структуры ДНК стволовой петли на начальных этапах, LAMP использует прядь-вытесняя полимеразу дна эффективно усилить этот стартовый материал квази-экспоненциально, в результате чего10 9 копий цели менее чем за 1 ч1. По сравнению с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), широко используемой NAAT, LAMP обладает рядом преимуществ. Во-первых, реакции LAMP проводятся в изотермальных условиях. Это устраняет необходимость в сложном тепловом велосипеде. Во-вторых, LAMP очень терпимо относится к культурным СМИ и биологическимвеществам 2 с надежностью, продемонстрированой как для клинических, таки для пищевых применений 3,4. Это упрощает подготовку образца и сводит к минимуму ложные отрицательныерезультаты 5. В-третьих, LAMP является подложкой для нескольких платформ обнаружения, таких как мутность, колориметрия, биолюминесценция, флуоресценция, имикрофлюиды 6. В-четвертых, LAMP является весьма конкретным, поскольку он использует четыре-шесть специально разработанных грунтовок для целевой шесть-восемьконкретных регионов 1,7. В-пятых, LAMP является сверхчувствительным и многочисленные исследования сообщили о своей превосходной чувствительности к ПЦР или в режиме реального времени PCR8. Наконец, LAMP быстрее со многими анализами в настоящее время принятие 30 мин стандартного времени, в то время как ПЦР типа анализы обычно принимают 1’2 ч8.
Эти привлекательные особенности подпитывали применение LAMP в широких областях обнаружения патогенов, включая диагностику в пробирке 9,диагностику болезней животных 10,а также пищевые и экологическиеиспытания 11. Примечательно, что TB-LAMP (LAMP для микобактерий туберкулеза) был рекомендован ВОЗ в качестве действительного теста замены для микроскопии мокроты мазка для диагностики туберкулеза легких в периферическихусловиях 12. Приложение LAMP также выходит за рамки микробной идентификации, чтобы включить обнаружение аллергенов, видов животных, лекарственной устойчивости, генетически модифицированных организмов и пестицидов13.
Нетифоидная сальмонелла является зоонозным патогеном существенной безопасности пищевых продуктов и общественного здравоохранения озабоченность во всем мире14. Он также был определен в качестве важной микробной опасности в пище для животных (т.е. животногопитания) 15,16. Для предотвращения болезней сальмонеллы / вспышек от загрязненной пищи человека и продуктов животного происхождения, крайне важно иметь быстрые, надежные и надежные методы для тестирования сальмонеллы в различных матриц. В последнее десятилетие, значительные усилия были предприняты на международном уровне по разработке и применению сальмонеллы LAMP анализы в широком спектре пищевых матриц, как недавно обобщены в обширномобзоре 8. Несколько анализов Salmonella LAMP, в том числе один представленный здесь, успешно завершили много лабораторной проверки после устоявшихся международныхруководящих принципов 17,18,19,20.
Наша salmonella LAMP анализ конкретно цели salmonella вторжения гена invA (GenBank присоединения номер M90846)21 и является быстрым, надежным и надежным в нескольких матрицпищи 4,22,23,24,25,26. Метод был проверен в шести матриц корма для животных в предварительном исследовании26 и в сухой корм для собак в многолабораторном совместном исследовании19. В результате, метод Salmonella LAMP представленный здесь недавно был включен в Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) Бактериологическое аналитическое руководство (BAM) Глава 5 Сальмонеллы27 служить двум целям, один как метод быстрого скрининга на наличие сальмонеллы в животной пище и два в качестве надежного метода подтверждения предполагаемой сальмонеллы изолированы от всех продуктов питания.
Мы представили здесь простой, быстрый, конкретный и чувствительный метод LAMP для скрининга и подтверждения сальмонеллы в пище животных и чистой культуре, соответственно. С удобством изотермальной смеси мастер, который содержит четыре ключевых реагентов, и готовый к использованию, в доме подготовлен грунтовка смесь, сборка реакции LAMP требует лишь несколько шагов трубы (Рисунок 1). Общее время времени времени времени, включая усиление и аннеальные фазы, составляет менее 38 мин(рисунок 2A,B и рисунок 3A,B). Положительные результаты отслеживаются с помощью флуоресценциив режиме реального времени (рисунок 2C и рисунок 3C,D)и могут быть обнаружены уже в 5мин 26. Аннеальная фаза служит дополнительным подтверждением специфичности LAMP, так как только образцы с правильным Tm (около 90 градусов по Цельсию) сообщаются как положительные(рисунок 2D,E и рисунок 3E’G). Чувствительность 1 клетка сальмонеллы в чистой культуре и Lt; 1 CFU/25 г в животной пище были зарегистрированы ранее26.
Как LAMP является довольно эффективным и генерирует большое количествоДНК 1, очень важно, чтобы лучшие лабораторные практики используются для предотвращения перекрестного загрязнения, которые могут включать в себя физическое разделение областей для подготовки LAMP мастер смеси и добавления шаблонов ДНК, избегая генерации аэрозолей, используя фильтр пипетки советы, изменение перчатки часто, и воздерживаться от открытия ЛАМП реакции труб после усиления.
Специфика этого метода Salmonella LAMP ранее была протестирована с использованием 300 бактериальных штаммов (247 сальмонеллы 185 серов и 53 не-сальмонеллы ) и продемонстрировала, что 100% конкретные26. Примечательно, что значительные различия в Tmax наблюдались между двумя видами сальмонеллы, S. enterica и Salmonella bongori, а также среди подвидов S. enterica, особенно subsp. arizonae (IIIa)26. Тем не менее, они по-прежнему являются действительными положительными результатами по правилам интерпретации результатов LAMP. В нашем многолабораторном совместном исследовании в сухом корме для собак, в которомприняли участие 14 аналитиков 19, образцы, имеющие несовместимые результаты в дублировать LAMP работает иногда наблюдается. Они обычно участвуют образцы с задержкойположительных результатов (Tмакс йgt; 15 мин). Повторение обоих запусков самостоятельно обычно решает проблему. Реже мы наблюдали образцы с правильным T m,но нет или нерегулярные значения Tmax (lt; 5 мин). Обычно это было вызвано пузырьками воздуха в реакционной трубке.
На протяжении всего жизненного цикла разработки метода LAMP, оценки, преколлаборативного исследования и многолабораторной проверки, мы наблюдали высокую толерантность LAMP к ингибиторам в различных животных пищевых или пищевыхматриц и культурных средств массовойинформации 4,19,22,23,24, подчеркивая надежность метода и сотрудничая многочисленные другие исследования в глобальноммасштабе 8. Это выше по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени, что обычно требует внутреннего контроля усиления, чтобы гарантировать, что отрицательные результаты не из-за матричногоингибирования 28. Кроме того, LAMP продемонстрировал аналогичную (или превосходящий) специфичность и чувствительность по сравнению с ПЦР или ПЦР в режиме реального времени в подавляющем большинствеисследований 8. Стоимость реагентов LAMP составляет около $ 1 за реакцию. Инструменты LAMP, используемые в этом протоколе, являются небольшими, низким уровнем обслуживания и портативными. Они могут обрабатывать любой изотермальный метод усиления, который использует целевое обнаружение путем измерения флуоресценции, LAMP включены. Используя программное обеспечение LAMP, всеобъемлющие отчеты могут быть сгенерированы в нескольких форматах (pdf, текст и изображение).
Проверка метода является критическим шагом, прежде чем новый метод может быть принят для регулярного использования. Примечательно, что протокол LAMP, о котором сообщается здесь, успешно завершил многобораторную проверку19. С недавним включением этого протокола LAMP в БАМ США Глава 5 Сальмонеллы27, ожидается,что метод получит гораздо более широкое использование, как как метод быстрого скрининга в животной пище и в качестве надежного метода подтверждения для предполагаемого salmonella изолирует от всех категорий продуктов питания.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят членов FDA микробиологии Методы проверки подкомитета (MMVS) и бактериологических аналитических Руководство (BAM) Совета для критического рассмотрения сальмонеллы LAMP метод проверки исследований.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |