靶向神经元损伤实现脑环路的非侵入性断开

摘要

本实验方案的目的是提供一种在脑内产生非侵入性神经元损伤的方法。该方法利用磁共振引导聚焦超声（MRgFUS）以短暂且局灶性的方式打开血脑屏障，从而将循环中的神经毒素递送至脑实质。

摘要

手术干预在治疗某些药物难治性神经系统疾病方面可能非常有效。对于癫痫和运动障碍等具有明确神经环路机制的疾病，这一方法尤为适用。目前可用的手术方式虽然有效，但通常需要进行侵入性手术操作，可能导致非靶向组织的手术损伤。因此，若能拓展手术治疗手段，纳入一种既非侵入性又无神经毒性的技术，将具有重要价值。

本文介绍了一种以非侵入性方式在脑内产生局灶性神经元损伤的方法。该方法利用低强度聚焦超声联合静脉注射微泡，实现血脑屏障（BBB）的短暂且局灶性开放。在此短暂的血脑屏障开放期间，可将系统性给予的神经毒素靶向递送至特定脑区。喹啉酸（QA）通常无法透过血脑屏障，静脉或腹腔注射时耐受性良好；然而，当 QA 直接进入脑组织时，会对神经元产生毒性作用。该方法已在大鼠和小鼠中用于靶向特定脑区。在磁共振引导聚焦超声（MRgFUS）后，立即通过增强T1加权成像确认血脑屏障开放的成功。术后T2成像显示脑损伤局限于靶区，且可通过组织学技术在死后验证靶区内神经元的丢失。值得注意的是，注射生理盐水而非 QA 的动物虽表现出血脑屏障开放，但未出现损伤或神经元丢失。该方法被称为精确非侵入性脑内引导手术（Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery, PING），可能为治疗与神经环路异常相关的神经系统疾病提供一种非侵入性手段。

引言

该方法的目的是提供一种在脑部特定区域产生非侵入性神经元损伤的手段。开发此类方法的理论依据是中断参与神经系统疾病的神经环路。例如，手术在治疗某些药物难以控制的神经系统疾病方面可能非常有效，如耐药性癫痫（DRE）¹。然而，现有的各种手术方式在避免对脑组织造成不希望的附带损伤方面均存在局限性。传统的切除性手术具有高度侵入性，可能带来出血、感染、血栓、中风、癫痫发作、脑肿胀以及神经损伤等风险²。相较于切除性手术，一些微创或非侵入性替代方案包括激光间质热疗和放射外科手术，这些方法也被证明在抑制DRE癫痫发作方面有效。最近，高强度聚焦超声（HIFU）产生的热损伤在减少癫痫发作方面显示出良好前景。HIFU是一种非侵入性技术；然而，由于存在对邻近颅骨区域的非靶向组织造成热损伤的风险，目前其治疗窗口仅限于脑部更中心的区域。尽管存在这些限制，手术的益处通常超过潜在风险。例如，尽管DRE手术可能导致脑部附带损伤，但其在抑制癫痫发作和改善生活质量方面的有益效果通常超过手术风险。

本文所述的方法——精确非侵入性颅内引导手术（Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery, PING）——旨在切断神经环路的同时，最大限度地减少对脑组织的附带损伤。该方法利用低强度聚焦超声结合静脉注射微泡，以开放血脑屏障（BBB），从而递送神经毒素。该方法不会在脑组织中产生热损....

方案

本文所述所有方法均已获得弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 试剂的准备

1. 手术当天，准备 6.0 mL 可注射的喹啉酸（QA）。将 450 mg QA 溶解于 4.0 mL 1.0 N NaOH 中，加入 0.6 mL 10x PBS，调节 pH 至 7.4，再用 dH₂O 定容至终体积 6.0 mL。经 0.22 µm 注射器滤器过滤。该溶液在 4 °C 下可稳定保存 2 周。
2. 通过探头超声将十氟丁烷气体在生理盐水中制备成微泡水分散液，并以 DSPC/PEG 硬脂酸盐单层壳结构进行稳定¹²。
3. 在常重力条件下通过浮选法对微泡进行粒径筛选。使用 Multisizer III 计数器通过电阻脉冲感应法测定微泡浓度和粒径分布。微泡浓度应为 6 × 10⁸/mL，平均粒径约为 2 μm。通过浮选排阻/分离法去除较大的气泡。
4. 或者，可直接购买市售的微泡制剂。

2. 动物准备

1. 动物（大鼠或小鼠）送达后需适应环境 3 天。本实验所用动物为 Sprague-Dawley 大鼠（5–6 周龄）或端脑内结构异位（tish）大鼠（本单位饲养种群）。
2. 将动物饲养于 12 小时光照：12 小时黑暗的循环环境....

结果

本部分描述了PING对位于新皮质发育不良区域中神经元的作用。组织发育不良是药物难治性癫痫患者脑部的常见特征，手术切除致痫性发育不良组织可有效控制癫痫发作¹⁵。因此，明确PING对发育不良脑组织的影响具有重要意义。为研究这一问题，选择了遗传性皮质发育不良的大鼠模型——tish大鼠，因为tish大鼠脑内存在发育不良组织（皮层下带状异位），位于结构正常的新皮质下方（图3）¹⁶。该发育不良区域及其上方的新皮质均含有功能性的神经元，并表现出典型的新皮质连接特性^17,18。

针对Tish大鼠脑内异位组织的PING治疗在诱导畸形神经元局灶性丢失方面是有效的（图3）。PING处理后一天获取的T2加权成像显示高信号区域，与靶向超声区域的组织损伤表现一致。PING处理后5天.......

讨论

PING 方法旨在产生非侵入性、靶向性的神经元损伤。该方法建立在聚焦超声领域日益坚实且不断扩展的研究基础之上^3,4,5,6,7。通过暂时性开放血脑屏障（BBB），实现对脑实质特定区域的局灶性通达，从而为递送多种通常无法进入大脑的物质提供了途径。目前这一机会主要被用于中枢递送那些BBB通透性较差的治疗剂。PING 方法则以不同的方式利用了这一机会，即递送一种神经毒素，最终目的是破坏导致神经功能障碍的神经环路。异常的神经环路是外科干预以减轻某些神经系统疾病影响的有效靶点^2,15。PING 方法的长期目标是增强当前可用于切断导致神经功能障碍环路的技术手段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7T-ClinScan MRI 系统	布鲁克生物自旋公司，埃廷根，德国		MR图像采集
声学凝胶	Litho CLEAR	11-601	高粘度声学耦合凝胶
DPX 封片介质	电子显微镜科学公司	13512	基于树脂的盖玻片封固剂
氟乳玉B	EDM Millipore	AG310	高亲和力变性神经元染色法
Fluovac 麻醉吸附器	哈佛仪器	34-0388	有机麻醉废气清除剂
FUS 系统	影像引导治疗，佩萨克，法国	LabFUS	磁共振兼容的小动物聚焦超声系统
钆双胺	GE Healthcare AS，挪威奥斯陆	Omniscan	磁共振造影剂
肝素	SAGENT	NDC2502140010	抗凝剂
30G × 1/2 英寸皮下注射针头	Becton-Dickinson	26027	尾静脉插管
胰岛素注射器 28G1/2（1 ml）	EXEL	26027	尾静脉导管注射给药
异氟烷雾化器	SurgiVet	VCT302	麻醉给药
异氟烷	Henry Schein	NDC1169567762	麻醉
KMnO4	Sigma	223468	荧光素B染色中使用的试剂
微泡	内部制作：A. Klibanov	305106	血脑屏障破坏剂
微泡（商业来源）	Lantheus Medical Imaging，美国马萨诸塞州北比勒里卡	Definity 微泡	血脑屏障破坏剂
监测 &和门控系统	小型动物实验仪器	Model 1030	呼吸监测
Multisizer 3 库尔特计数器	贝克曼库尔特，佛罗里达州海厄利亚	Multisizer 3	用于测定微泡的平均尺寸
Optixcare 眼部润滑剂	CLC MEDICA，加拿大安大略省	11611	角膜保护剂-眼用润滑剂
PE10导管	Becton-Dickinson	427401	尾静脉导管组件
喹啉酸	Santa Cruz Biotechnology，达拉斯，德克萨斯州	CAS 89-00-9	神经毒素
Sprague-Dawley 大鼠	Taconic Biosciences	SD-M	大鼠模型
注射泵	卡内基医学	CMA 100	喹啉酸的可控递送
Thermoguide 软件	影像引导治疗，佩萨克，法国	Thermoguide	驱动实验室FUS系统
蒂什大鼠	内部品系		大鼠模型
Veet 脱毛膏	Reckitt Benckiser		去除头皮毛发