낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 치료 응용 프로그램
Summary
여기에 제출된 것은 낭포성 섬유증(CF) 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염 및 파지 치료 응용 프로그램에 대한 프로토콜이다.
Abstract
항균 저항, 진단 불확실성및 항균 과처방의 주요 결과, 우리 사회와 건강 시스템에 큰 영향을 미치는 전 세계적으로 심각한 감염, 합병증 및 사망의 점점 인식되는 원인입니다. 특히, 면역 체계가 손상되거나 낭포성 섬유증(CF)과 같은 기존 및 만성 병리를 가진 환자는 다약물 내성 분리물의 출현 및 확산으로 감염을 제어하는 빈번한 항생제 치료를 받게 된다. 따라서 세균 감염에 대처하기 위한 대체 요법을 해결해야 할 긴급한 필요성이 있습니다. 박테리아의 자연적인 적인 박테리오파지의 사용은 가능한 해결책이 될 수 있습니다. 이 작품에 자세히 설명 된 프로토콜은 CF 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염에 대한 파지 치료의 적용을 설명합니다. Zebrafish 배아는 CF 배아에서 치사성, 세균성 부담 및 염증성 면역 반응을 감소시키기 때문에 파지 치료가 P. aeruginosa 감염에 효과적이라는 것을 증명하기 위해 P. aeruginosa에 감염되었습니다.
Introduction
파지 요법은 세균 감염과 싸우기 위해 박테리아의 자연적인 적의 사용으로 항생제에 대한 세균 저항이 널리 퍼지면서 새로운 관심을 얻고 있다1,,2. 동유럽에서 수십 년 동안 사용되는 이 치료법은 CF 를 사용한 환자에서 폐 감염을 경화시키는 항생제에 대한 보완적 치료법으로 간주될 수 있으며 현재 사용 중인 모든 항생제에 내성이 있는 박테리아에 감염된 환자에 대한 가능한 치료 대안으로 간주될 수 있다2,,3. 항생제 치료의 장점은 세균세포가 감염 부위에서 증식하는 반면 항생제는 대사되고4신체4,5에서제거된다는 것이다. 실제로, 다른 실험실에서 분리된 악성 파지의 칵테일의 투여는 곤충과 포유류6,67,7,8과다른 동물 모델의 슈도모나스 아루기노사 감염을 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 파지 요법은 또한 P. aeruginosa 및 Escherichia 대장균에 감염된 화상 상처에 있는 세균성 부담을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 9 무작위 임상 시험9.
Zebrafish(Danio rerio)는최근 P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium 농양 및 버콜데리아 세파시아,12,13을포함하여 여러 병원균으로 감염을 연구하는 귀중한 모델로 부상했습니다. 배아 혈액 순환에 직접 박테리아를 마이크로 주입함으로써제브라피시 선천적 면역 계통에 의해 상쇄되는 전신 감염을 확립하기 쉬우며, 이는 인간과 유사한 호중구 및 대식세포 생성과 함께 진화적으로 보존된다. 더욱이, 생활의 첫번째 달 도중, 제브라피시 태아는 적응성 면역 반응이 결여되어, 인간 폐 감염에 있는 중요한 방어 기계장치인 선천적인 면역을 공부하기 위한 이상적인 모형을 만들기(15). Zebrafish는 최근에 CF 개시를 더 잘 이해하고 새로운 약리학적 치료를 개발하기 위해 강력한 유전 모델 시스템으로 등장10,,16,,17. 제브라피시에서 모르폴리노 주입으로 생성된, CFTR 노크다운CF제브라시 모델은 호흡 버스트 반응과 호중구 이동감소(10)를제시했으며, cftr 녹아웃은 내부 장기 위치및 외신 췌장의 파괴로 이어지며, 인간 질환을 반영하는 표현형인 외신 췌장의 파괴로 이어진다.1617 가장 큰 관심사는 P. aeruginosa 세균성 부담이 마우스와 인간 기관지 상피 세포2,,18로얻은 결과를 평행하게 하는 8시간 후 감염(hpi)에서 대조군에서 보다 cftr-손실-기능배아에서 현저히 높았다는 것을 발견하였다.
이 작품에서, 우리는 파지 치료가 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa 감염에 대하여 효과적이다는 것을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서, 우리는 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa (PAO1) 감염을 능력을 발휘하는 프로토콜을 설명하고 그것을 해결하기 위하여 PAO1를 감염시킬 수 있는 이전에 확인된 파지의 칵테일으로 파지 치료를 적용하는 방법을 기술했습니다. 항생제 치료에 대 한 대안으로 박 테리 오 파 지의 사용은 지난 몇 년 이후 증가 관심의 되었습니다. 이것은 주로 공중 보건을 위한 심각한 문제점을 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 이탈리아 낭포성 섬유증 재단 (FFC #22/2017)에 의해 지원되었다; 아소시아지오네 “글리 아미치 델라 리티” 카스키고와 FFC #23/2019; 피우 온루스 라 마노 테사 온루스에서 Un respiro).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
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