大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology,Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy,Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center,Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection,Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science,University of Science & Technology (UST)
Summary
ここでは、ラクトバチルス細胞遊離上清(LCFS)の抗癌効果を理解する方法が提示されている。大腸癌細胞株は、3D培養でLCFSで治療した場合の細胞死を示す。スキャフォールドの生成過程はスキャフォールドに応じて最適化でき、提示される解析方法は、関係するシグナル伝達経路を評価するのに有用である。
Abstract
本稿は、 乳酸菌 発酵細胞培養物 の上清を用いた多細胞型癌細胞の三次元(3D)スフェロイドにおける癌細胞死亡を評価するプロトコルを、プロバイオティクス培養物と考える。 ラクトバチルス 細胞遊離上清(LCFS)をテストするための3D培養物の使用は、特に L.発酵 が腸内で抗癌効果を生み出すことができるため、2D単層での試験よりも優れた選択肢です。 L.発酵 物上清は、3D培養条件で複数の大腸癌(CRC)細胞に対する抗増殖効果の増加を有することを同定した。興味深いことに、これらの効果は培養モデルと強く関連し 、L.発酵 が癌細胞死を誘導する顕著な能力を示した。安定したスフェロイドは、以下に示すプロトコルを用いて多様なCRC(大腸癌細胞)から生成された。3Dスフェロイドを生成するこのプロトコルは、時間の節約とコスト効率が高いです。このシステムは、複数のタイプのCRCスフェロイドにおけるLCFSの抗癌効果を容易に調べる開発された。予想通り、LCFSで処理されたCRCスフェロイドは、実験中に細胞死を強く誘導し、qRT-PCR、ウェスタンブロッティング、およびFACS分析によって分析された特定のアポトーシス分子マーカーを発現した。したがって、この方法は、細胞の生存率を探索し、抗癌薬の有効性を評価するために有用である。
Introduction
プロバイオティクスは、免疫恒常性および宿主エネルギー代謝を改善する腸内で最も有利な微生物である1.乳酸菌およびビフィズス菌からのプロバイオティクスは腸内で見つかったその種の最も先進的な 2,3.これまでの調査では、ラクトバチルスは大腸癌を含むいくつかの癌に対して阻害および抗増殖効果を有することが示されている。また、プロバイオティクスは炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎5,6を予防する。しかし, プロバイオティクスを用いたほとんどの研究は、2 次元で行われました (2D) 固体表面上で成長している単層.
人工培養システムは、がん細胞にとって自然ではない環境特性を欠いています。この制限を克服するために、3次元(3D)培養システムが7,8に開発されている。3Dにおける癌細胞は、細胞生存率、増殖、形態、細胞細胞通信、薬物感受性、および生体内関連性9,10などの基本的な生物学的機構の点で改善を示す。さらに、スフェロイドは、多細胞型の大腸癌から作製され、細胞間相互作用および細胞外マトリックス(ECM)11に依存する。我々の以前の研究は、ラクトバチルス発酵を用いて産生されたプロバイオティクス無細胞上清(CFS)が大腸癌(CRC)細胞12の3D培養に抗癌効果を示したことを報告した。我々は、CFSが3Dスフェロイド12に対するプロバイオティクス効果をテストするための適切な代替戦略であることを提案した。
ここでは、プロバイオティクス無細胞上清(CFS)の治療効果を複数の3D大腸癌模倣システムに対する分析のために、多細胞型の3D大腸癌に対応できるアプローチを提示する。この方法は、インビトロで関連プロバイオティクスと抗癌効果の分析のための手段を提供します。.
Protocol
1. 細菌細胞培養と ラクトバチルス 細胞フリー上清(LCFS)の調製 注:ステップ1.2 – 1.9は嫌気性の部屋で行われます。 L-システインを含むMRS寒天プレートとブロスを準備し、オートクレーブで殺菌します。 20 ppm酸素で37 °Cで維持されたH2 嫌気性チャンバーにMRS寒天プレートをプレインキュベートします。 乳酸菌の細菌ストックを解?…
Representative Results
多様な大腸癌細胞株からスフェロイドを得るプロトコルについて述べています。メチルセルロースによる補充は、スフェロイドを生成するために必要とされた。また、LCFS調製の方法を提示し、プロバイオティクスと大腸癌の相関関係を研究するモデルを提示する。スフェロイド形成およびLCFS調製プロトコルは、図1A,Bに概略的に示される。?…
Discussion
隣接する細胞および細胞外マトリックス(ECM)を含む組織微小環境は、組織発生の基本であり、細胞増殖および組織発達13の制御において極めて重要である。しかし、2D培養物には、細胞間相互作用の中断、細胞形態の変化、細胞外環境、および分割14のアプローチなど、いくつかの欠点がある。3D細胞培養システムは、生体内の効果をより良く再現するために…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、韓国規格研究所が出資する「化学・放射線測定基準の確立」、助成番号KRISS-2020-GP2020-0003、「生物材料と医療収束のための測定基準と技術の開発」によって支援されました。また、科学・ICT省、韓国国立研究財団(NRF-2019M3A9F3065868)、厚生省(MOHW)、韓国保健産業開発研究所(KHIDI、HI20C0558)、貿易産業エネルギー省(MOTIE)、韓国工業技術研究所(KEIT)、韓国評価研究所20009350も支援しました。ORCID ID(ヒーミンユー:0000-0002-5951-2137;ドゥッジンカン:0000-0002-5924-9674;Seilキム: 0000-0003-3465-7118;ジュウン・リー: 0000-0002-2495-1439;ジナ・リー:0000-0002-3661-3701)。チャン・ウー・パークの実験支援に感謝します。
Materials
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti – p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
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Lee, J., Lee, J., Kim, S., Kang, D., Yoo, H. M. Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (160), e61285, doi:10.3791/61285 (2020).