JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Røntgenkrystallografi for å studere oligomerisk tilstand overgang av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Denne protokollen er utviklet for å studere dimer-dodecamer overgangen av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på strukturelt nivå. Det er en enkel rørledning som starter fra proteinrensing til røntgendatabehandling. Krystalllogenese, datasettindeksering og molekylær erstatning har blitt vektlagt gjennom et tilfelle av studier, TmPep1050H60A H307A-variant.

Abstract

M42 aminopeptidaser danner funksjonelt aktive komplekser laget av 12 underenheter. Deres monteringsprosess ser ut til å være regulert av deres metallionkofaktorer som utløser en dimer-dodecamer overgang. Ved binding av metallion forekommer flere strukturelle modifikasjoner på det aktive stedet og på interaksjonsgrensesnittet, og former dimers for å fremme selvmonteringen. For å observere slike modifikasjoner må stabile oligomerer isoleres før strukturstudier. Rapportert her er en metode som tillater rensing av stabile dodecamers og dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, og deres struktur bestemmelse av røntgenkrystallografi. Dimers ble utarbeidet fra dodecamers ved å fjerne metallioner med et chelating middel. Uten sin kofaktor ble dodecamers mindre stabile og ble fullstendig dissosiert ved oppvarming. De oligomeriske strukturene ble løst ved den enkle molekylære erstatningstilnærmingen. For å illustrere metodikken presenteres strukturen til en TmPep1050-variant, helt svekket i metallionbinding, som ikke viser ytterligere nedbryting av dimers til monomerer.

Introduction

Oligomerisering er en dominerende prosess som dikterer de biologiske funksjonene til mange proteiner. I Escherichia colier det anslått at bare 35% av proteinene er monomeriske1. Noen proteiner, kalt morfoseiner, kan til og med vedta flere oligomeriske tilstander med underenheter som har distinkt struktur i hver oligomeriske tilstand2. Overgangen mellom deres oligomeriske tilstander er ofte et middel til å regulere proteinaktivitet, da hver oligomeriske tilstand kan ha en annen spesifikk aktivitet eller funksjon. Flere eksempler på morfoeiner har blitt godt dokumentert i litteraturen, spesielt porphobilinogen synthase3, HPr kinase / fosfat dehydrogenase7, pyruvat dehydrogenase6, glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase7, pyruvat kinase8, citrate synthase9, og ribonuclease A10. Nylig beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, et annet eksempel på enzym med morfeeinlignende oppførsel, hvis aktivitet avhenger av oligomeriske tilstander11. Overgangen mellom de oligomeriske statene er mediert av sine metalliske kofaktorer som induserer flere strukturelle modifikasjoner av underenhetene.

M42 aminopeptidase familien tilhører MH klanen12,13, og er utbredt blant bakterier og Arkaea14. M42 aminopeptidasene er ekte dinukleærenzymer som nedbryter peptider opptil 35 aminosyrerester i lengde15. De vedtar en særegen tetrahedron-formet struktur laget av 12 underenheter med sine aktive steder orientert mot et indre hulrom. Et slikt arrangement blir ofte beskrevet som en nano-compartmentalization av aktiviteten for å unngå ukontrollert proteolyse. Den fysiologiske funksjonen til M42 aminopeptidasene kan være forbundet med proteasom, hydrolyserende peptider som følge av proteinnedbrytning16,17. Pyrococcus horikoshii har fire M42 aminopeptidaser, hver presenterer distinkte, men komplementære spesifisiteter18,19,20,21. Entall, heterocomplexes laget av to forskjellige typer underenheter har blitt beskrevet i P. horikoshii, noe som tyder på eksistensen av peptidasome komplekser22,23.

Flere strukturer av M42 aminopeptidaser har blitt beskrevet ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten består av to forskjellige domener, et katalytisk domene og et dimmeriseringsdomene. Det katalytiske domenet vedtar en felles α / β fold bevart i hele MH-klanen, det arketypiske katalytiske domenet er aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringdomenet vedtar en PDZ-lignende fold16 og kan ha, i tillegg til sin rolle i oligomeriseringen, en rolle i å kontrollere substrattilgang og binding i det indrehulrommet 11. Som den grunnleggende byggesteinen er en dimer, blir dodecamer ofte beskrevet som foreningen av seks dimers, hver dimer blir plassert på hver kant av tetrahedron16. Oligomeriseringen av M42-aminopeptidasene er avhengig av tilgjengeligheten av metallkofaktorene. Divalente metallioner, ofte Zn2+ og Co2+, er katalytisk involvert i peptidbindingen og hydrolysen. De finnes i to forskjellige bindingssteder, nemlig M1 og M2 nettsteder. De to metallionene kjører og finjusterer også oligomeriseringen som demonstrert for PhTET2, PhTET3, PfTET3 og TmPep105011,24,28,29. Når metallkofaktorene er tømt, demonteres dodecameren i dimers, som i PhTET2, PhTET3 og TmPep105011,16,28eller til og med monomerer, som i PhTET2 og PfTET324,29.

Presentert her er en protokoll som brukes for å studere strukturene til TmPep1050 oligomers. Denne protokollen er et sett med vanlige metoder, inkludert proteinrensing, proteolytisk aktivitetsscreening, krystallisering, røntgendiffraksjon og molekylær erstatning. Finesser som er iboende til å håndtere metalloenzymer, protein oligomerisering, proteinkrystallisering og molekylær erstatning er vektlagt. Et tilfelle av studier er også presentert for å vise om TmPep1050 dodecamers kan ytterligere dissosiere til monomerer eller ikke. For å løse dette spørsmålet har en TmPep1050-variant, TmPep1050H60A H307A, blitt studert hvis metallbindingssteder er svekket ved å mutere His-60 (M2-området) og His-307 (M1-området) til Ala-rester. Denne protokollen kan innkvarteres for å studere andre M42 aminopeptidaser eller metalloenzymer med morfoein-lignende atferd.

Protocol

1. Produksjon og rensing av rekombinant TmPep1050 MERK: Heretter er beskrevet kloning prosedyre og rensing av vill-type TmPep1050 tilpasset fra en tidligere studie11. Alternativt kan kloningen gjøres ved hjelp av et syntetisk gen. Hvis du vil generere TmPep1050-varianter, kan områderettet mutagenese utføres følgende, for eksempel én primerreaksjonene i parallellprotokoll (SPRINP)-metoden30. Renseprotokollen kan brukes for TmPep1050-varianter. …

Representative Results

For å studere en mulig dodecamer dissosiasjon til monomerer i TmPep1050, ble His-60 og His-307 codons erstattet av alaninkodon ved hjelp av et syntetisk gen. Dette genet ble deretter klonet i pBAD vektor for uttrykk og rensing av den tilsvarende TmPep1050-varianten senere kalt TmPep1050H60A H307A. Størrelse eksklusjon kromatografi (Figur 3B) viste at renset protein hadde en tilsynelatende molekylvekt på 56 kDa (molekylvekt av monomer er 36,0 kDa). En lignende tilsynelatende mol…

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gjør det mulig å forstå den dimer-dodecamer overgangen til TmPep1050 på strukturnivå. Metodikken ble opplevd tidligere for å bestemme strukturen til både TmPep1050 oligomers11. Det mest utfordrende trinnet var å finne forhold som fremmet dissosiasjon av dodecamers til stabile dimers. Slike forhold måtte være milde nok til å tillate reassociation av dimers i dodecamers når metallionkofaktoren ble lagt til. Separasjonen av oligomerer var også et kritisk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Martine Roovers for korrekturlesing av dette papiret og gi konstruktive kommentarer. Tilgang til Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var innenfor Block Allocation Groups 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image