JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Рентгеновская кристаллография для изучения олигомерского государства Переход Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Этот протокол был разработан для изучения димер-додекамер переход TmPep1050, M42 аминоптидазы, на структурном уровне. Это простой трубопровод, начиная от очистки белка и обработки рентгеновских данных. Кристалллогенез, индексация набора данных и молекулярная замена были подчеркнуты в ходе исследования, tmPep1050H60A H307A вариант.

Abstract

Аминопептиды M42 образуют функционально активные комплексы из 12 подразделений. Их процесс сборки, как представляется, регулируется их металлических ионных кофакторов запуска димер-додекамер перехода. При связывании металлических ионов в активном месте и интерфейсе взаимодействия происходит несколько структурных модификаций, формирующих димеры для содействия самосожасыву. Для наблюдения за такими изменениями, стабильные олигомеры должны быть изолированы до структурного исследования. Сообщается, что здесь метод, который позволяет очистки стабильных додекамеров и димеров TmPep1050, M42 aminopeptidase T. maritima, и их структура определения рентгеновской кристаллографии. Димеры были подготовлены из додекамеров путем удаления металлических ионов с хелатирующим агентом. Без кофактора додекамеры стали менее стабильными и были полностью разобщены при нагревании. Олигомерные структуры были решены с помощью простого молекулярного подхода к замене. Чтобы проиллюстрировать методологию, представлена структура варианта TmPep1050, полностью нарушенного в металлической ионой привязке, не показывающей дальнейшего разбивки димеров на мономеры.

Introduction

Олигомеризация является преобладающим процессом, который диктует биологические функции многих белков. В Escherichia coli, подсчитано, что только 35% белков мономерных1. Некоторые белки, называемые морфиинами, могут даже принять несколько олигомерных состояний с субъединицами, имеющих различную структуру в каждом олигомеромсостоянии 2. Переход между их олигомерными состояниями часто является способом регулирования белковой активности, поскольку каждое олигомерное состояние может иметь различную специфическую активность или функцию. Несколько примеров морфиены были хорошо документированы в литературе, в частности, porphobilinogenсинтазы 3, HPr киназы /фосфатазы 4, Лон протеазы5, лактатдегидрогеназы 6, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы7, пируваткиназы 8, цитратсинтазы 9, и рибонуклеаза10. Недавно мы описали M42 aminopeptidase TmPep1050, еще один пример фермента с морфеином, как поведение, чья активность зависит от его олигомерныхсостояний 11. Переход между олигомерными состояниями опосредован его металлическими кофакторами, которые вызывают несколько структурных модификаций подразделений.

Семейство аминопептидазы M42 принадлежит к клану MH12,13, и широко распространено среди бактерий и Archaea14. M42 aminopeptidases являются подлинными динуклеарными ферментами, унижающими пептиды до 35 аминокислотных остатков в длину15. Они принимают своеобразную тетраэдрообразную структуру из 12 подразделений с их активными участками, ориентированными на внутреннюю полость. Такое расположение часто описывается как нано-разобщение деятельности, чтобы избежать неконтролируемого протеолиза. Физиологическая функция M42 aminopeptidases может быть связана с протеасомой, гидролизующих пептидов в результатедеградации белка 16,17. Pyrococcus horikoshii обладает четырьмя аминоптидами M42, каждая из которых представляет различные, новзаимодополняющие особенности 18,19,20,21. Сингулярно, гетерокомплексы из двух различных типов подразделений были описаны в P. horikoshii, предполагая существование пептидасомныхкомплексов 22,23.

Несколько структур M42 aminopeptidases были описаны влитературе 11,16,18,19,20,24,25,26. Подразделение состоит из двух различных областей, каталитический домен и домен димеризации. Каталитический домен принимает общий α/β, сохраненный во всем клане MH, архетипический каталитический домен является аминокислотой Ap1 из Vibrio proteolyticus27. Домен димеризации принимает PD-как раз16 и может иметь, в дополнение к своей роли в олигомеризации, роль в управлении доступом к субстрату и связывания во внутренней полости11. Поскольку основной строительный блок является более тусклым, dodecamer часто описывается как объединение шести димеров, каждый димер, расположенный на каждом краю тетраэдр16. Олигомеризация аминопептидас M42 зависит от наличия его металлических кофакторов. Ионы металла Divalent, часто«n 2» и Co2, каталитически участвуют в пептидной привязке и гидролизе. Они находятся в двух различных связывающих участках, а именно на участках М1 и М2. Два металлических ионов также диск и тонко настроить олигомеризации, как попродемонстрировано для PhTET2, PhTET3, PfTET3, и TmPep105011,24,28,29. Когда металлические кофакторы истощаются, dodecamer разбирает на димеры, как в PhTET2, PhTET3, и TmPep105011,16,28, или даже мономеры, как в PhTET2 и PfTET324,29.

Здесь представлен протокол, используемый для изучения структур олигомеров TmPep1050. Этот протокол представляет собой набор распространенных методов, включая очищение белка, скрининг протеолитической активности, кристаллизацию, рентгеновскую дифракцию и молекулярную замену. Подчеркиваются тонкости, присущие работе с металлоконструкцимами, олигомеризацией белка, кристаллизацией белка и молекулярной заменой. Пример исследования также представлен, чтобы показать, может ли tPep1050 dodecamers еще больше разобщиться на мономеры или нет. Для решения этого вопроса, вариант TmPep1050, TmPep1050H60A H307A, был изучен, чьи металлические связывающие сайты нарушаются путем мутации Его-60 (M2 сайт) и его-307 (M1 сайт) в Ала остатков. Этот протокол может быть размещен для изучения других M42 aminopeptidases или любые metalloenzymes с морфеином, как поведение.

Protocol

1. Производство и очистка рекомбинантных TmPep1050 ПРИМЕЧАНИЕ: В дальнейшем описаны процедуры клонирования и очистки дикого типа TmPep1050 адаптированы из предыдущего исследования11. Кроме того, клонирование может быть сделано с помощью синтетического гена. Для генер…

Representative Results

Для изучения возможной диссоциации додекамера в мономеры в TmPep1050, его-60 и его-307 кодоны были заменены аланином кодоном с использованием синтетического гена. Затем этот ген был клонирован в векторе PBAD для выражения и очистки соответствующего варианта TmPep1050, впоследствии названного TmPep1050<…

Discussion

Описанный в настоящем настоящем протоколе позволяет понять переход TmPep1050 на структурном уровне. Методология была испытана ранее для определения структуры обоих TmPep1050 олигомеров11. Наиболее сложным шагом было найти условия, способствующие разобщению додекамеров в стабиль?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Мартину Руверс за то, что она корректировал этот документ и давал конструктивные комментарии. Доступ к лучей Proxima 2 (SYNChrotron SOLEIL) был в пределах групп распределения блоков 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image