JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

X-Ray Kristallografi att studera oligomeric staten Övergång av Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Detta protokoll har utvecklats för att studera dimer-dodecamer övergången av TmPep1050, en M42 aminopeptidase, på den strukturella nivån. Det är en enkel pipeline som börjar från proteinrening till röntgendatabehandling. Crystallogenesis, data set indexering och molekylär ersättning har betonats genom ett fall av studie, TmPep1050H60A H307A variant.

Abstract

M42 aminopeptidases bildar funktionellt aktiva komplex gjorda av 12 subenheter. Deras monteringsprocess verkar regleras av deras metalljonkofaktorer som utlöser en dimer-dodecamer-övergång. Vid metalljonbindning förekommer flera strukturella modifieringar i den aktiva platsen och vid interaktionsgränssnittet, som formar dimrar för att främja självmonteringen. För att observera sådana modifieringar måste stabila oligomerer isoleras före strukturell studie. Rapporteras här är en metod som gör det möjligt att rening av stabila dodecamers och dimers av TmPep1050, en M42 aminopeptidase av T. maritima, och deras struktur bestämning genom röntgenkristallografi. Dimers var beredda från dodecamers genom att ta bort metalljoner med en kelatbildare. Utan sin kofaktor blev dodecamers mindre stabila och var helt dissocierade vid uppvärmning. De oligomeric strukturerna löstes genom den enkla molekylära ersättningsstrategin. För att illustrera metodiken presenteras strukturen hos en TmPep1050-variant, helt nedsatt i metalljonbindning, som inte visar någon ytterligare uppdelning av dimers till monomerer.

Introduction

Oligomerisering är en dominerande process som dikterar de biologiska funktionerna hos många proteiner. I Escherichia coli, uppskattas det att endast 35% av proteinerna är monomeriska1. Vissa proteiner, som kallas morpheeins, kan även anta flera oligomeric stater med underenheter har distinkt struktur i varje oligomeric tillstånd2. Övergången mellan deras oligomeric tillstånd är ofta ett medelvärde för att reglera protein aktivitet som varje oligomeric tillstånd kan ha en annan specifik aktivitet eller funktion. Flera exempel på morfeeiner har dokumenterats väl i litteraturen, 4 , Lonprotease5,lakt dehydrogenas6, glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenas7, pyruvatkins8, citratsyntas9, och ribonucase A10. Nyligen beskrev vi M42 aminopeptidase TmPep1050, ett annat exempel på enzym med morpheein-liknande beteende, vars aktivitet beror på dess oligomeric stater11. Övergången mellan dess oligomeric tillstånd förmedlas av dess metalliska kofaktorer som inducerar flera strukturella ändringar av underenheterna.

M42 aminopeptidase familjen tillhör MHklanen 12,13, och är allmänt fördelad bland Bakterier och Archaea14. Den M42 aminopeptidases är äkta dinukleära enzymer förnedrande peptider upp till 35 aminosyra rester i längd15. De antar en säregen tetraederformad struktur gjord av 12 subenheter med sina aktiva platser orienterade mot en inre hålighet. Ett sådant arrangemang beskrivs ofta som en nano-compartmentalization av verksamheten för att undvika okontrollerad proteolys. Den fysiologiska funktionen hos M42-aminopeptidaserna kan vara förknippad med de proteasom, hydrolyserande peptider somhärrör från proteinnedbrytning 16,17. Pyrococcus horikoshii besitter fyra M42 aminopeptidases, var och en presenterar distinkta men kompletterande särdrag18,19,20,21. Singularly, heterokomplex gjorda av två olika typer av underenheter har beskrivits i P. horikoshii, vilket tyder på förekomsten av peptidasome komplex22,23.

Flera strukturer av M42 aminopeptidases har beskrivits ilitteraturen 11,16,18,19,20,24,25,26. Underenheten är sammansatt av två distinkta domäner, en katalytisk domän och en dimeriseringsdomän. Den katalytiska domänen antar en gemensam α/β faldig bevaras i hela MH klanen, den arketypiska katalytiska domänen är aminopeptidase Ap1 av Vibrio proteolyticus27. Dimeriseringsdomänen antar en PDZ-liknande fold16 och kan ha, förutom sin roll i oligomeriseringen, en roll i att kontrollera substratåtkomst och bindning i den inre håligheten11. Eftersom den grundläggande byggstenen är en dimer, är dodecamer ofta beskrivs som sammanslutning av sex dimers, varje dimer placeras vid varje kant av tetraeder16. Den oligomerization av M42 aminopeptidases förlitar sig på tillgången på dess metall kofaktorer. Divalent metalljoner, ofta Zn2+ och Co2+, är katalytiskt involverade i peptidbindningen och hydrolysen. De finns i två distinkta bindningsplatser, nämligen M1- och M2-platser. De två metalljonerna kör också ochfinjusteraroligomeriseringen som den demonstreras för PhTET2, PhTET3, PfTET3, och TmPep1050 11,24,28,29. När metallkofaktorerna är uttömda, de isär de dodecamer i dimers, som i PhTET2, PhTET3, och TmPep105011,16,28, eller ens monomerer, som i PhTET2 och PfTET324,29.

Presenteras här är ett protokoll som används för att studera strukturerna i TmPep1050 oligomerer. Detta protokoll är en uppsättning vanliga metoder inklusive protein rening, proteolytic aktivitet screening, kristallisering, röntgen diffraktion, och molekylär ersättning. Subtiliteter inneboende att hantera metalloenzymer, protein oligomerization, protein kristallisering och molekylär ersättning betonas. Ett fall av studie presenteras också för att visa om TmPep1050 dodecamers kan ytterligare dissociate i monomerer eller inte. För att ta itu med denna fråga, en TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, har studerats vars metall bindningsställen är nedsatt genom att mutera His-60 (M2 plats) och His-307 (M1 plats) till Ala rester. Detta protokoll kan rymmas för att studera andra M42 aminopeptidases eller någon metalloenzymes med morpheein-liknande beteende.

Protocol

1. Produktion och rening av rekombinant TmPep1050 OBS: Härefter beskrivs kloningsproceduren och rening av wild-type TmPep1050 anpassad från en tidigare studie11. Alternativt kan kloningen göras med hjälp av en syntetisk gen. För att generera TmPep1050-varianter kan site directed mutagenesis utföras efter till exempel enkelprimerreaktionerna i metoden för parallel protocol (SPRINP)30. Reningsprotokollet kan användas för TmPep1050-varianter….

Representative Results

För att studera en eventuell dodecamer dissociation i monomerer i TmPep1050, hans-60 och hans-307 kodon ersattes av alanin kodon med hjälp av en syntetisk gen. Denna gen var sedan klonas i pBAD vektor för uttryck och rening av motsvarande TmPep1050 variant senare heter TmPep1050H60A H307A. Storlek uteslutning kromatografi (Figur 3B) visade att det renade proteinet hade en uppenbar molekylvikt på 56 kDa (molekylvikt av monomeren är 36,0 kDa). En liknande skenbar molekylvikt, 5…

Discussion

Det protokoll som beskrivs häri gör det möjligt att förstå dimer-dodecamer övergången av TmPep1050 på strukturell nivå. Metoden upplevdes tidigare för att fastställa strukturen för både TmPep1050 oligomerer11. Det mest utmanande steget var att hitta villkor som främjar dissociation av dodecamers i stabila dimers. Sådana villkor måste vara mild nog att tillåta reassociation av dimers i dodecamers när metalljon kofaktorn lades till. Avskiljandet av oligomers var också ett kritiskt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar Martine Roovers för korrekturläsning av detta dokument och ger konstruktiva kommentarer. Access till Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) var inom Block Allocation Groups 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image