JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

Published: May 13, 2020
doi:
10.3791/61288
, , ,
1Laboratory of Microbiology, Department of Molecular Biology,Université Libre de Bruxelles, 2Labiris Institut de Recherche

Summary

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

Abstract

De M42 aminopeptidases vormen functioneel actieve complexen gemaakt van 12 subeenheden. Hun assemblageproces lijkt te worden gereguleerd door hun metalen ionen cofactoren triggering een dimer-dodecamer overgang. Bij metaalionbinding vinden verschillende structurele wijzigingen plaats in de actieve site en op de interactie-interface, waardoor dimers worden gevormd om de zelfassemblage te bevorderen. Om dergelijke wijzigingen waar te nemen, moeten stabiele oligomeren vóór de structurele studie worden geïsoleerd. Hier gemeld is een methode die het mogelijk maakt de zuivering van stabiele dodecamers en dimers van TmPep1050, een M42 aminopeptidase van T. maritima, en hun structuur bepaling door X-ray kristallografie. Dimers werden bereid van dodecamers door het verwijderen van metalen ionen met een chelaatvormer. Zonder hun cofactor werden dodecamers minder stabiel en werden ze volledig gescheiden bij verwarming. De oligomeric structuren werden opgelost door de ongecompliceerde moleculaire vervangingsbenadering. Ter illustratie van de methodologie wordt de structuur van een TmPep1050-variant, volledig aangetast in metaalionbinding, gepresenteerd waaruit blijkt dat er geen verdere uitsplitsing van dimers op monomeren wordt weergegeven.

Introduction

Oligomerisatie is een overheersend proces dat de biologische functies van veel eiwitten dicteert. In Escherichia coliwordt geschat dat slechts 35% van de eiwitten monomeerbaar is1. Sommige eiwitten, genaamd morpheeins, kunnen zelfs verschillende oligomerische toestanden aannemen met subeenheden met een duidelijke structuur in elke oligomerische toestand2. De overgang tussen hun oligomerische toestanden is vaak een gemiddelde om eiwitactiviteit te reguleren, omdat elke oligomerische toestand een andere specifieke activiteit of functie kan hebben. Verschillende voorbeelden van morpheeins zijn goed gedocumenteerd in de literatuur, met name de porphobilinogen synthase3, HPr kinase/phosphatase4, Lon protease5, lactate dehydrogenase6, glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase7, pyruvate kinase8, citraat synthase9, en ribonuclease A10. Onlangs hebben we beschreven de M42 aminopeptidase TmPep1050, een ander voorbeeld van enzym met morphein-achtig gedrag, waarvan de activiteit afhankelijk is van zijn oligomerieke toestanden11. De overgang tussen de oligomerische toestanden wordt bemiddeld door zijn metaalcofactoren die verschillende structurele wijzigingen van de subeenheden veroorzaken.

De M42 aminopeptidase familie behoort tot de MH clan12,13, en wordt op grote schaal verspreid onder Bacteriën en Archaea14. De M42 aminopeptidases zijn echte dinucleaire enzymen die peptiden tot 35 aminozuurresten in lengte15degraderen. Ze nemen een eigenaardige tetraëdervormige structuur aan die bestaat uit 12 subeenheden met hun actieve locaties gericht op een innerlijke holte. Een dergelijke regeling wordt vaak beschreven als een nano-compartimentering van de activiteit om ongecontroleerde proteolyse te voorkomen. De fysiologische functie van de M42 aminopeptidases kan worden geassocieerd met het proteasoom, hydrolyserende peptiden als gevolg van eiwitafbraak16,17. Pyrococcus horikoshii bezit vier M42 aminopeptidases, die elk verschillende maar complementaire specificiteiten18,19,20,21presenteren . Bijzonder, heterocomplexen gemaakt van twee verschillende soorten subeenheden zijn beschreven in P. horikoshii, wat wijst op het bestaan van peptidasome complexen22,23.

Verschillende structuren van M42 aminopeptidases zijn beschreven in de literatuur11,16,18,19,20,24,25,26. De subunit bestaat uit twee verschillende domeinen, een katalytisch domein en een dimerisatiedomein. De katalytische domein neemt een gemeenschappelijke α / β vouw bewaard in de hele MH-clan, de archetypische katalytische domein wordt de aminopeptidase Ap1 van Vibrio proteolyticus27. De dimerization domein neemt een PDZ-achtige vouw16 en kan, naast zijn rol in de oligomerisatie, een rol hebben bij het regelen van substraattoegang en binding in de binnenholte11. Aangezien de basisbouwsteen een dimer is, wordt de dodecamer vaak omschreven als de associatie van zes dimers, waarbij elke dimer aan elke rand van de tetraëder16wordt geplaatst. De oligomerisatie van de M42 aminopeptidases is afhankelijk van de beschikbaarheid van zijn metaalcofactoren. Divalent metaalionen, vaak Zn2+ en Co2+, zijn katalytisch betrokken bij de peptide binding en hydrolyse. Ze zijn te vinden in twee verschillende bindende sites, namelijk M1 en M2 sites. De twee metalen ionen rijden ook en stemmen de oligomerisatie zoals aangetoond voor PhTET2, PhTET3, PfTET3 en TmPep105011,24,28,29. Wanneer de metaalcofactoren uitgeput zijn, demonteert de dodecamer in dimers, zoals in PhTET2, PhTET3 en TmPep105011,16,28of zelfs monomeren, zoals in PhTET2 en PfTET324,29.

Hier gepresenteerd is een protocol dat wordt gebruikt voor het bestuderen van de structuren van TmPep1050 oligomers. Dit protocol is een reeks gemeenschappelijke methoden, waaronder eiwitzuivering, proteolytische activiteitscreening, kristallisatie, röntgendiffractie en moleculaire vervanging. Subtiliteiten die inherent zijn aan het omgaan met metalloenzymen, eiwit oligomerisatie, eiwit kristallisatie en moleculaire vervanging worden benadrukt. Er wordt ook een studiegeval gepresenteerd om aan te tonen of TmPep1050 dodecamers zich verder kunnen distantiëren in monomeren of niet. Om deze vraag te beantwoorden, een TmPep1050 variant, TmPep1050H60A H307A, is onderzocht waarvan de metalen binding sites worden aangetast door het muteren van His-60 (M2 site) en His-307 (M1 site) naar Ala residuen. Dit protocol kan worden ondergebracht om andere M42 aminopeptidases of metaalloenzymen met morpheein-achtig gedrag te bestuderen.

Protocol

1. Productie en zuivering van recombinant TmPep1050 OPMERKING: Hierna worden de kloonprocedure en de zuivering van wild-type TmPep1050 aangepast aan een eerdere studie11beschreven . Als alternatief kan het klonen worden gedaan met behulp van een synthetisch gen. Om TmPep1050-varianten te genereren, kan site directed mutagenesis worden uitgevoerd volgens bijvoorbeeld de single-primer reacties in parallel protocol (SPRINP) methode30. Het zuiveringspr…

Representative Results

Om een mogelijke dodecamer dissociatie in monomeren in TmPep1050 te bestuderen, werden de His-60 en His-307 codons vervangen door alanine codon met behulp van een synthetisch gen. Dit gen werd vervolgens gekloond in pBAD vector voor expressie en zuivering van de overeenkomstige TmPep1050 variant vervolgens genaamd TmPep1050H60A H307A. Grootte uitsluiting chromatografie (Figuur 3B) toonde aan dat het gezuiverde eiwit had een schijnbare moleculaire gewicht van 56 kDa (moleculair gew…

Discussion

Het protocol hierin beschreven maakt het mogelijk inzicht in de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050 op structureel niveau. De methodologie werd eerder ervaren voor het bepalen van de structuur van beide TmPep1050 oligomers11. De meest uitdagende stap was het vinden van voorwaarden ter bevordering van de dissociatie van dodecamers in stabiele dimers. Dergelijke omstandigheden moesten mild genoeg zijn om de koppeling van dimers in dodecamers mogelijk te maken toen de metaal-ionencofactor werd toe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Martine Roovers voor het nalezen van deze krant en het geven van constructieve opmerkingen. Toegang tot Proxima 2 beamline (SOLEIL synchrotron) viel binnen Block Allocation Groups 20151139.

Materials

1,10-phenanthroline Sigma-Aldrich 13, 137-7
Amicon Ultra 0.5 ml Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC503096
Amicon Ultra 15 Centrifugal Filters Ultracel 30K Merck Millipore UFC903024
Benzonase Nuclease Merck Millipore 70664-3
CCP4 N/A visit http://www.ccp4.ac.uk/
cOmplete EDTA-free Roche 5056489001
Coot N/A visit https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
Crystal Screen I Hampton Research HR2-110
Crystal Screen II Hampton Research HR2-112
DreamTaq Green PCR Master Mix ThermoFisher Scientific K1082
EasyXtal 15-well tool NeXtal 132007
Escherichia coli PPY strain N/A see reference 31
Escherichia coli XL1 blue strain Agilent 200249
Gel Filtration Calibration Kit HMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-42
Gel Filtration Calibration Kit LMW GE Healthcare Life Sciences 28-4038-41
Gel Filtration Standard Biorad 1511901
GeneJET Plasmid Miniprep Kit ThermoFisher Scientific K0503
Index Hampton Research HR2-144
Litholoops Molecular Dimensions
L-leucine-p-nitroanilide Bachem AG 40010720025
Natrix 1 Hampton Research HR2-116
Natrix 2 Hampton Research HR2-117
Neggia plugin Dectris N/A visit https://www.dectris.com/
NeXtal Tubes JCSG Core Suite I NeXtal 130724
NeXtal Tubes JCSG Core Suite II NeXtal 130725
NeXtal Tubes JCSG Core Suite III NeXtal 130726
NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV NeXtal 130727
pBAD-TOPO ThermoFisher Scientific K430001
Phenix N/A visit https://www.phenix-online.org/
Phusion High-Fidelity DNA polymerase ThermoFisher Scientific F-530L
Salt RX 1 Hampton Research HR2-107
Salt RX 2 Hampton Research HR2-109
SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO ThermoFisher Scientific 88242
Source 15Phe GE Healthcare Life Sciences 17014702
Source 15Q GE Healthcare Life Sciences 17094705
Superdex 200 prep grade GE Healthcare Life Sciences 17104301
Thermotoga maritima MSB8 strain American Type Culture Collection ATCC 43589
TmCD00089984 DNASU Plasmid Repository N/A
XDS N/A visit http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/
xdsme N/A visit https://github.com/legrandp/xdsme
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levy, E. D., Teichmann, S. A. Structural, Evolutionary, and Assembly Principles of Protein Oligomerization. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 117, 25-51 (2013).
  2. Selwood, T., Jaffe, E. K. Dynamic dissociating homo-oligomers and the control of protein function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 131-143 (2012).
  3. Jaffe, E. K. The Remarkable Character of Porphobilinogen Synthase. Accounts of Chemical Research. 49 (11), 2509-2517 (2016).
  4. Ramström, H., et al. Properties and Regulation of the Bifunctional Enzyme HPr Kinase/Phosphatase in Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 1174-1185 (2003).
  5. Rudyak, S. G., Brenowitz, M., Shrader, T. E. Mg2+-Linked Oligomerization Modulates the Catalytic Activiy of the Lon (La) Protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. 40 (31), 9317-9323 (2001).
  6. Yamamoto, S., Storey, K. B. Dissociation-Association of lactate dehydrogenase Isozymes: Influences on the formation of tetramers vs. dimers of M4-LDH and H4-LDH. International Journal of Biochemistry. 20 (11), 1261-1265 (1988).
  7. Sirover, M. A. Structural analysis of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase functional diversity. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 57, 20-26 (2014).
  8. Gupta, V., Bamezai, R. N. K. Human pyruvate kinase M2: A multifunctional protein: Multifunctional Human PKM2. Protein Science. 19 (11), 2031-2044 (2010).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: Structure, Control, and Mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Libonati, M., Gotte, G. Oligomerization of bovine ribonuclease A: structural and functional features of its multimers. Biochemical Journal. 380 (2), 311-327 (2004).
  11. Dutoit, R., et al. How metal cofactors drive dimer-dodecamer transition of the M42 aminopeptidase TmPep1050 of Thermotoga maritima. Journal of Biological Chemistry. 294 (47), 17777-17789 (2019).
  12. Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46 (1), 624-632 (2018).
  13. Neuwald, A. F., Liu, J. S., Lipman, D. J., Lawrence, C. E. Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research. 25 (9), 1665-1677 (1997).
  14. Dutoit, R., Brandt, N., Legrain, C., Bauvois, C. Functional Characterization of Two M42 Aminopeptidases Erroneously Annotated as Cellulases. PLoS ONE. 7 (11), 50639 (2012).
  15. Franzetti, B., et al. Tetrahedral aminopeptidase: a novel large protease complex from archaea. The EMBO Journal. 21 (9), 2132-2138 (2002).
  16. Borissenko, L., Groll, M. Crystal Structure of TET Protease Reveals Complementary Protein Degradation Pathways in Prokaryotes. Journal of Molecular Biology. 346 (5), 1207-1219 (2005).
  17. Appolaire, A., et al. TET peptidases: A family of tetrahedral complexes conserved in prokaryotes. Biochimie. 122, 188-196 (2016).
  18. Russo, S., Baumann, U. Crystal Structure of a Dodecameric Tetrahedral-shaped Aminopeptidase. Journal of Biological Chemistry. 279 (49), 51275-51281 (2004).
  19. Schoehn, G., et al. An Archaeal Peptidase Assembles into Two Different Quaternary Structures: A tetrahedron and a giant octahedron. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 36327-36337 (2006).
  20. Durá, M. A., et al. The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea: Characterization of P. horikoshii TET3 peptidase. Molecular Microbiology. 72 (1), 26-40 (2009).
  21. Basbous, H., Appolaire, A., Girard, E., Franzetti, B. Characterization of a Glycyl-Specific TET Aminopeptidase Complex from Pyrococcus horikoshii. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00059 (2018).
  22. Appolaire, A., et al. Small-angle neutron scattering reveals the assembly mode and oligomeric architecture of TET, a large, dodecameric aminopeptidase. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 70 (11), 2983-2993 (2014).
  23. Appolaire, A., et al. The TET2 and TET3 aminopeptidases from P yrococcus horikoshii form a hetero-subunit peptidasome with enhanced peptide destruction properties: TET aminopeptidase multi-subunit complex. Molecular Microbiology. 94 (4), 803-814 (2014).
  24. Colombo, M., Girard, E., Franzetti, B. Tuned by metals: the TET peptidase activity is controlled by 3 metal binding sites. Scientific Reports. 6 (1), 20876 (2016).
  25. Petrova, T. E., et al. Structure of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (3), 277-285 (2015).
  26. Kim, D., et al. Structural basis for the substrate specificity of PepA from Streptococcus pneumoniae, a dodecameric tetrahedral protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391 (1), 431-436 (2010).
  27. Chevrier, B., et al. Crystal structure of Aeromonas proteolytica aminopeptidase: a prototypical member of the co-catalytic zinc enzyme family. Structure. 2, 283-291 (1994).
  28. Rosenbaum, E., Ferruit, M., Durá, M. A., Franzetti, B. Studies on the parameters controlling the stability of the TET peptidase superstructure from Pyrococcus horikoshii revealed a crucial role of pH and catalytic metals in the oligomerization process. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1814 (10), 1289-1294 (2011).
  29. Macek, P., et al. Unraveling self-assembly pathways of the 468-kDa proteolytic machine TET2. Science Advances. 3 (4), 1601601 (2017).
  30. Edelheit, O., Hanukoglu, A., Hanukoglu, I. Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies. BMC Biotechnology. 9 (1), 61 (2009).
  31. Zhang, Y., Werling, U., Edelmann, W. SLiCE: a novel bacterial cell extract-based DNA cloning method. Nucleic Acids Research. 40 (8), 55 (2012).
  32. Schleif, R. AraC protein, regulation of the l-arabinose operon in Escherichia coli, and the light switch mechanism of AraC action. FEMS Microbiology Reviews. 34 (5), 779-796 (2010).
  33. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  34. Bergfors, T. Seeds to crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 66-76 (2003).
  35. Dauter, Z. Collection of X-Ray Diffraction Data from Macromolecular Crystals. Protein Crystallography. 1607, 165-184 (2017).
  36. Powell, H. R. X-ray data processing. Bioscience Reports. 37 (5), 0227 (2017).
  37. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 271-281 (2011).
  38. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  39. Clabbers, M. T. B., Gruene, T., Parkhurst, J. M., Abrahams, J. P., Waterman, D. G. Electron diffraction data processing with DIALS. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (6), 506-518 (2018).
  40. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
  41. Legrand, P. . legrandp/xdsme: March 2019 version working with the latest XDS version. , (2019).
  42. Evans, P. Scaling and assessment of data quality. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 72-82 (2006).
  43. Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for non-crystallographers, or how to get the best (but not more) from published macromolecular structures: Protein crystallography for non-crystallographers. FEBS Journal. 275 (1), 1-21 (2008).
  44. Karplus, P. A., Diederichs, K. Assessing and maximizing data quality in macromolecular crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 34, 60-68 (2015).
  45. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).
  46. Rossmann, M. G., Blow, D. M. The detection of sub-units within the crystallographic asymmetric unit. Acta Crystallographica. 15, 24-31 (1962).
  47. Rossmann, M. G. The molecular replacement method. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 46 (2), 73-82 (1990).
  48. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674 (2007).
  49. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 213-221 (2010).
  50. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  51. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (1), 12-21 (2010).
  52. Zwart, P. H., Grosse-Kunstleve, R. W., Lebedev, A. A., Murshudov, G. N., Adams, P. D. Surprises and pitfalls arising from (pseudo)symmetry. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 99-107 (2008).
  53. Yeates, T. O. Detecting and overcoming crystal twinning. Methods in Enzymology. 276, 344-358 (1997).
  54. Terwilliger, T. C. Using prime-and-switch phasing to reduce model bias in molecular replacement. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 60 (12), 2144-2149 (2004).
  55. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (1), 61-69 (2008).
  56. Krissinel, E., Henrick, K. Inference of Macromolecular Assemblies from Crystalline State. Journal of Molecular Biology. 372 (3), 774-797 (2007).

Tags

X-ray CrystallographyOligomeric StateThermotoga MaritimaAminopeptidaseTmPep1050Activity AssayApoenzyme PreparationDialysisUltrafiltration
check_url/61288?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dutoit, R., Brandt, N., Van Elder, D., Droogmans, L. X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050. J. Vis. Exp. (159), e61288, doi:10.3791/61288 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image