Kontinuierliche Messung des biologischen Rauschens in Escherichia Coli mittels Zeitraffermikroskopie

Summary

Diese Arbeit stellt eine Mikroskopiemethode vor, die eine Live-Bildgebung einer einzelnen Zelle von Escherichia coli zur Analyse und Quantifizierung des stochastischen Verhaltens synthetischer Genkreise ermöglicht.

Abstract

Das hier entwickelte Protokoll bietet ein Tool, um die Computerverfolgung der Escherichia coli-Division und der Fluoreszenzüberschüsse über mehrere Stunden hinweg zu ermöglichen. Der Prozess beginnt mit einem Screening auf Kolonien, die auf minimalen Medien überleben, vorausgesetzt, dass nur Escherichia coli, die das richtige Plasmid beherbergt, in der Lage sein wird, unter den spezifischen Bedingungen zu gedeihen. Da der Prozess des Aufbaus großer genetischer Schaltkreise, der die Montage vieler DNA-Teile erfordert, eine Herausforderung darstellt, werden Schaltkreiskomponenten oft zwischen mehreren Plasmiden in verschiedenen Kopiernummern verteilt, die den Einsatz mehrerer Antibiotika erfordern. Mutationen im Plasmid können die Transkription der Antibiotikaresistenzgene zerstören und mit Ressourcenmanagement in der Zelle intervenieren, was zu Nekrose führt. Die ausgewählte Kolonie wird auf einer Glasboden-Petrischale gesetzt und einige Fokusebenen werden für die Mikroskopie-Tracking in hellen Feld- und Fluoreszenzdomänen ausgewählt. Das Protokoll behält den Bildfokus für mehr als 12 Stunden unter anfänglichen Bedingungen, die nicht reguliert werden können, was einige Schwierigkeiten verursacht. Zum Beispiel beginnen sich abgestorbene Zellen im Fokusfeld der Linsen nach ein paar Stunden der Bildgebung anzusammeln, was dazu führt, dass sich Giftstoffe ansammeln und das Signal verschwimmt und zerfällt. Der Erschöpfungswert von Nährstoffen führt zu neuen Stoffwechselprozessen und behindert die gewünschte Reaktion des Kreislaufs. Die Temperatur des Experiments senkt die Wirksamkeit von Induktoren und Antibiotika, was die Zuverlässigkeit des Signals weiter beeinträchtigen kann. Das minimale Mediengel schrumpft und trocknet, und dadurch ändert sich der optische Fokus im Laufe der Zeit. Wir haben diese Methode entwickelt, um diese Herausforderungen in Escherichia colizu überwinden, ähnlich wie frühere Arbeiten, die analoge Methoden für andere Mikroorganismen entwickeln. Darüber hinaus bietet diese Methode einen Algorithmus zur Quantifizierung des gesamten stochastischen Rauschens in unveränderten und veränderten Zellen und stellt fest, dass die Ergebnisse mit den Strömungsanalysevorhersagen übereinstimmen, wie ein ähnlicher Variationskoeffizient (CV) zeigt.

Introduction

Synthetische Biologie ist ein multidisziplinäres Feld, das in den letzten zehn Jahren entstanden ist und darauf abzielt, technische Designprinzipien in rationales biologisches Design zu übersetzen^1,2,3, in dem Bemühen, Multi-Signal-Integration und Verarbeitung in lebenden Zellen für das Verständnis der grundlegenden Wissenschaft⁴,⁵, diagnostische, therapeutische und biotechnologische Anwendungen^6,7,8,9,10zu erreichen. Unsere Fähigkeit, die Input-Output-Antwort synthetischer Genkreise zu quantifizieren, wurde durch die jüngsten Fortschritte in der Einzelzelltechnologie, einschließlich des Durchflussanalysators und der Live-Zell-Bildgebung mittels automatisierter Zeitraffermikroskopie¹¹, revolutioniert. Ein Strömungsanalysator wird häufig verwendet, um das Ansprechen dieser Schaltkreise im stationären Zustand^1,12, und invertierte Mikroskopie wird verwendet, um die dynamische Reaktion von synthetischen Genkreisen auf der Ebene einer einzelnen Zelle³zu messen. Zum Beispiel, eine der frühen Arbeiten in der synthetischen Biologie beinhaltete den Aufbau von genetischen Oszillator-Netzwerken in lebenden Zellen mit negativen Rückkopplungsschleifen mit einer Verzögerung³. Später wurden die genetischen Oszillator-Schaltungen angewendet, um die metabolische Kontrolle in der dynamischen Umgebung der lebenden Zellen zu verstehen⁴. Die automatisierte Zeitraffermikroskopie ist eine Methode, um solche Schaltkreise zu charakterisieren. Wir vermuten, dass die Wirtszellen, Escherichia coli, bei der Bildung von Mikrokolonien synchronisieren, was die Messung von Signal und die Berechnung von Rauschen ermöglicht, ohne genaue Mutter-Tochter-Beziehungen zu verfolgen.

Lärm ist ein grundlegender, inhärenter Aspekt biologischer Systeme, die oft aus mehreren Quellen stammen. Man denke beispielsweise an biochemische Reaktionen mit Signalen, die aus dem Transport diskreter Zufälliger Träger wie die Diffusion von Proteinen¹³stammen. Diese Signale verbreiten sich mit zufälligen Schwankungen¹⁴. Weitere Lärmquellen sind Ressourcenverfügbarkeit, Zellteilung und Schwankungen der Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Druck. Biologische Signale, die sich in synthetischen Genkreisen ausbreiten, haben oft ein sehr niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), das die Leistung solcher Schaltkreise stört. Daher bleibt das genetische Schaltungsdesign einer der anspruchsvollsten Aspekte der Gentechnik¹⁵. Im Gegensatz zu den meisten Ansätzen, die nur die mittlere Genexpression berechnen (gemessen über die gesamte Zellpopulation), wird die Varianz des gemessenen Signals berücksichtigt, um ein vorhersagbares Verhalten durch synthetische Gennetzwerke zu entwickeln¹². Daher spielen die Variabilitäts- oder Rauschengrade in der Proteinexpression eine dominierende Rolle bei der Gestaltung und Leistung analoger und digitaler Genkreise^1,16,17.

Viele Ansätze wurden entwickelt, um die Zell-zu-Zell-Variabilität zu quantifizieren, unter anderem in Escherichia coli^3,7,18. Diese Methoden werden häufig verwendet, um Genaktivierung und Stoffwechselwege zu studieren, jedoch mit weniger Fokus auf die Untersuchung der stochastischen Lärmdynamik, wie das Messen und Entwirren spezifischer Lärmquellen, insbesondere für genetische Schaltkreise in lebenden Zellen, wo dies eine grundlegende Herausforderung ist^19,20,21. Mehrere Faktoren, die sowohl an den Schaltkreis selbst (intrinsisch) vererbt als auch von den Wirtszellen abgeleitet werden (extrinsisch), können die kontinuierliche Leistung genetischer Schaltkreise stören. In diesem Beitrag haben wir ein Protokoll entwickelt, das darauf abzielt, das Gesamtrauschen in Escherichia coli-Zellen zu quantifizieren, einschließlich der intrinsischen und extrinsischen Lärmquellen^6,22. Durch quantifizieren des Gesamtrauschens und anschließende Bewertung des SNR²³kann die Konstruktion von Genkreisläufen verbessert werden. Diese Methode kann modifiziert werden, um unabhängige Rauschquellen getrennt zu messen, indem mehrere fluoreszierende Proteine^6,20überwacht werden. Für das hier beschriebene Protokoll halten wir die Umgebungsbedingungen gut kontrolliert und messen kontinuierlich die Aktivität von Zellen ohne Einfluss externer Faktoren. Wir messen das Signal von fluoreszierenden Proteinen in einzelnen Zellen im Laufe der Zeit und stellen es gleichzeitig unter einem Agarosesubstrat ab. Die resultierenden Bilder werden mit dem kundenspezifischen MATLAB des Labors analysiert.

Im Idealfall wird die kontinuierliche Messung der Echtzeitaktivität von fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle genaue Daten durch das Wachstum und die Teilung der Zellen erzeugen. Es ist jedoch schwierig, solche Daten zu erfassen. Dies ist auf den Abbau von fluoreszierenden Proteinen, bekannt als Photobleichung⁷, zurückzuführen, wenn sie im Anregungsprozess Strahlung ausgesetzt sind. Darüber hinaus sind Escherichia coli Zellen auch empfindlich für die Anregung, die zu Phototoxizität führen könnte⁷. Beide Ausgaben begrenzen die Anzahl der fotorahmen, die erworben werden können, und die Zeit zwischen den Akquisitionen. Eine entscheidende Rolle spielen auch die Substrat- und Mitteltypen (z.B. Lysogeny-Brühe), die zum Wachstum der Zellen während der Bildgebung verwendet wird. Wir empfehlen dringend die Verwendung von minimalem Medium, das den nicht fluoreszierenden Hintergrund minimiert und die Zellteilungszeit verlängert.

Darüber hinaus muss die Probe unter Berücksichtigung der folgenden Anforderungen vorbereitet werden (1) Niedrige Zellteilungsrate ermöglicht weniger häufige Expositionen für die genaue Abbildung des Teilungszyklus und die Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Phototoxizität und Photobleichungen. Wir stellen die Erfassungszeit auf etwa die Hälfte der vorhergesagten Mitosezeit (2) Niedrige Zelldichte zu Beginn des Experiments ermöglicht eine bessere Homogenität und Nachverfolgbarkeit der Teilung. Die Zelldichte wird durch das Verdünnungsverhältnis der Escherichia coli-Zellen beeinflusst, das ein wichtiger Parameter für den Erfolg dieses Protokolls ist und für jedes Labor bestimmt werden muss. Um das Verhältnis zu ermitteln, sollte jeder neue Escherichia coli-Stamm oder jede verwendete Form mit Wachstumsratendiagrammen versehen werden (Zusatzabbildung 1). Ein angemessenes Verhältnis wurde erreicht, wenn Zellen nach einer kurzen Inkubation von einer Anfangsdichte von etwa OD_600nm = 0,1 ohne zusätzliches Schütteln wachsen können. Zellen in dieser Phase teilen sich nur nach der Umgebungstemperatur (3) Einschränkung der Zellbewegung: Die Zellbewegung hängt stark von der Festigkeit des Substrats (Agarosepad) ab. Die Festigkeit des Substrats hängt von der Menge der gesamten Agarose und der Gelerstarrungszeit ab. Gele können nicht über Nacht bei Raumtemperatur erstarren, da die Escherichia coli an Einer Mitose erleidet. Andere Faktoren, die die Substratstabilität beeinflussen, sind die Wassermenge in der Probe und die Feuchtigkeit. Weitere Fragen werden in den repräsentativen Ergebnissenausführlich erörtert. Dieses Protokoll bietet viele Details und wechselt schrittweise von einem Schritt zum anderen. Das Protokoll bietet lange Stabilität für Bildgebungsexperimente und bietet ein grundlegendes Bildverarbeitungswerkzeug.

Protocol

1. Medien- und Kulturvorbereitung Bereiten Sie die Stammlösung von 1.000x Carbenicillin (50 mg/ml) oder relevantem Antibiotikum vor. . Wiegen Sie 0,5 g Carbenicillin. 10 ml sterilhh2O. vollständig auflösen. Sterilisieren Sie Carbenicillin-Lager durch einen 0,22 m Spritzenfilter. Aliquot die Antibiotikum-Lösung und lagern bei -20 °C. Zur Herstellung von Lysogeny-Brühe (LB) Platten, mischen 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt und 7,5…

Representative Results

Die Software analysiert helle Feld-Domänenbilder, die nicht weiß und schwarz sind. Die Escherichia coli wird wie schwarze längliche Formen auf einem weißen Hintergrund aussehen und dynamischer Bereich der Luminanz sollte eine Spitze in ihrer Mitte zeigen (Abbildung 1). In fluoreszierenden Bildern können Zellen einen kleinen Halo haben, aber einzelne Zellen mit längigen Formen können immer noch aufgelöst werden. Ein Mitose-Ereignis sollte zuerst nach 30 Minuten erkannt werden…

Discussion

In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll entwickelt, das die Computerverfolgung von Escherichia coli-Lebendzellen ermöglicht, die Teilung und Fluoreszenzüberstand über einen Zeitraum von Stunden verfolgen. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die stochastische Dynamik genetischer Schaltkreise in Escherichia coli zu quantifizieren, indem wir den Lebenslauf und SNR in Echtzeit messen. In diesem Protokoll haben wir das stochastische Verhalten von zwei verschiedenen Schaltkreisen verglichen, wie in <stro…

Materials

35mm glass dish	mattek	P35G-0.170-14-C	thickness corresponding with microscope lense.
Agarose	Lonza	5004	LB preperation
AHL	Sigma-Aldrich	K3007	inducer
Bacto tryptone	BD – Becton, Dickinson and Company	211705	LB preperation
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotic
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotic
Casamino acids	BD – Becton, Dickinson and Company	223050	minimal media solution
eclipse Ti	nikon		inverted microscope
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	minimal media solution
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	minimal media substrate
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	immersion oil
M9 salt solution	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB preperation
Noble agar	Sigma-Aldrich	A5431	minimal media substrate
parafilm tape	Bemis	PM-996	refered to as tape in text
Seaplaque GTG Agarose	Lonza	50111	minimal media substrate
thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376	minimal media solution
Yeast Extract	BD – Becton, Dickinson and Company	212750	LB preperation