Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях
Summary
Здесь представлен химически определенный протокол для получения почек-подоцитов человека из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с высокой эффективностью (>90%) и независимо от генетических манипуляций или отбора субпопуляций. Этот протокол производит желаемый тип клеток в течение 26 дней и может быть полезен для тестирования нефротоксичности и моделирования заболеваний.
Abstract
Заболевание почек поражает более 10% мирового населения и обходится в миллиарды долларов федеральных расходов. Наиболее тяжелые формы заболевания почек и возможная конечная стадия почечной недостаточности часто вызваны повреждением клубочковых подоцитов, которые являются высокоспециализированными эпителиальными клетками, которые функционируют вместе с эндотелиальными клетками и клубочковой базальной мембраной для формирования фильтрационного барьера почки. Достижения в почечной медицине были затруднены ограниченной доступностью первичных тканей и отсутствием надежных методов получения функциональных клеток почек человека, таких как подоциты. Способность извлекать подоциты из возобновляемых источников, таких как стволовые клетки, может помочь продвинуть современное понимание механизмов развития и заболеваний почек человека, а также предоставить новые инструменты для терапевтических открытий. Целью этого протокола была разработка метода получения зрелых, постмитотических подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPS) с высокой эффективностью и специфичностью и в химически определенных условиях. Подоциты, полученные из клеток hiPS, продуцируемые этим методом, экспрессируют специфические для линии маркеры (включая нефрин, подоцин и опухоль Вильма 1) и проявляют специализированные морфологические характеристики (включая первичные и вторичные процессы стопы), связанные со зрелыми и функциональными подоцитами. Интересно, что эти специализированные особенности заметно отсутствуют в увековеченной клеточной линии подоцитов, широко используемой в этой области, что говорит о том, что протокол, описанный в настоящем описании, производит почки человека, которые имеют более зрелый фенотип, чем существующие клеточные линии подоцитов, обычно используемые для изучения биологии почек человека.
Introduction
Достижения в области культуры плюрипотентных стволовых клеток человека готовы революционизировать регенеративную медицину, моделирование заболеваний и скрининг лекарств, предоставляя исследователям возобновляемый, масштабируемый источник биологического материала, который может быть спроектирован для получения практически любого типа клеток в организме человека1. Эта стратегия особенно полезна для получения специализированных и функциональных типов клеток, которые в противном случае было бы трудно получить. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые (hiPS) клетки2,3,4,5 особенно привлекательны из-за их соматического клеточного происхождения и потенциала, который они представляют для персонализированной медицины. Однако разработка методов получения других клеточных линий из hiPS-клеток остается сложной задачей из-за частого использования плохо определенных условий культивирования, что приводит к низкой эффективности и неспецифической генерации гетерогенных клеточных популяций6,7.
Здесь представлен способ получения зрелых почечных подоцитов из hiPS-клеток со специфичностью и высокой эффективностью в химически определенных условиях. Рассматривая роль нескольких факторов в клеточной микросреде, была разработана стратегия дифференцировки стволовых клеток, которая включала оптимизацию растворимых факторов, представленных в среде клеточной культуры, а также нерастворимых факторов, таких как компоненты внеклеточного матрикса или адгезивные субстраты. Учитывая важность передачи сигналов интегрина в развитии и функции подоцитов, первоначально исследовалась экспрессия рецепторов интегрина на поверхности клетки. Интегрины β1 были высоко экспрессированы не только в hiPS-клетках, но и в их производных, включая мезодерму и промежуточные клетки мезодермы8,9,10. Последующие эксперименты подтвердили, что лиганды, которые связываются с интегринами β1 (включая ламинин 511 или фрагмент ламинина 511-E8), поддерживают адгезию и дифференцировку hiPS-клеток в подоциты при использовании в сочетании с растворимыми индуктивными средами, описанными ниже.
Индукция приверженности клеточной линии была инициирована первым подтверждением того, что hiPS-клетки, культивируемые на поверхностях, покрытых ламинином, в течение двух дней в присутствии среды, содержащей Activin A, CHIR99021 и ингибитор породы Y27632, могут дифференцироваться в клетки, которые экспрессируют ранние маркеры мезодермы HAND1, гусыневые и брахиуры8,11. Лечение клеток мезодермы в течение 14 дней средой, дополненной костным морфогенетическим белком 7 (BMP-7) и CHIR99021, позволило получить промежуточные клетки мезодермы, которые экспрессировали нефрон-прогениторные клеточные маркеры опухоли Вильма 1 (WT1), нечетно пропущенный родственный белок 1 (OSR1)8,11и парный белок бокс-гена 2 (PAX2)12. Чтобы получить зрелые почечные клубочковые подоциты, промежуточные клетки мезодермы обрабатывали в течение 4-5 дней новой средой, состоящей из BMP-7, активина А, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), полностьютранс-ретиноевой кислоты и CHIR99021. Проточная цитометрия и иммуноокрашивание были использованы для подтверждения того, что >90% полученных клеток проявляли молекулярные, морфологические и функциональные характеристики зрелых подоцитов почек8,11,13. К таким характеристикам относятся развитие первичных и вторичных процессов стопы; экспрессия специфических для линии подоцитов генов, включая SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 и экспрессию белков, включая подоцин, нефрин и WT114,15,16. Кроме того, было обнаружено, что подоциты, полученные из клеток hiPS, могут поддерживаться в культуре до четырех недель in vitro с использованием коммерчески доступной среды8,11, которая обеспечивает дополнительную гибкость в сроках последующих экспериментов. Для получения дополнительной информации о панелях проточной цитометрии, используемых для определения чистоты hiPS-подоцитов, пожалуйста, обратитесь к нашей предыдущей публикации11.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете мы описываем протокол генерации клубочковых подоцитов почек из hiPS-клеток. Подоциты, полученные из клеток hiPS, демонстрируют морфологические и молекулярные особенности, связанные со зрелым фенотипом подоцитов почек13. В предыдущих публикациях мы показали, что ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Инженерной школой Пратта в Университете Дьюка, Отделом нефрологии в Медицинской школе Дьюка, Премией за исследования кафедры от Департамента медицины в Университете Дьюка и Специальной премией Фонда Берроуза Wellcome FUND PDEP Career Transition Ad Hoc Award для S.M.. M.B была поддержана Программой стипендий для аспирантов Национального научного фонда. Мы благодарим лабораторию Bursac за щедрое предоставление нам линии стволовых клеток DU11 и лабораторию Варгезе в Университете Дьюка за временное совместное использование своего центра культивирование тканей с нашей группой. Эта публикация посвящена профессору Лауре Л. Кисслинг, профессору химии Novartis в Массачусетском технологическом институте, в честь празднования ее60-летия.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
