Diferenciação guiada de podocitos renais maduros de células-tronco pluripotentes induzidas humanas sob condições quimicamente definidas
Summary
Apresentado aqui é um protocolo quimicamente definido para a derivação de podocitos renais humanos de células-tronco pluripotentes induzidas com alta eficiência (>90%) e independente de manipulações genéticas ou seleção de subpopulação. Este protocolo produz o tipo de célula desejada dentro de 26 dias e pode ser útil para testes de nefrocoxicidade e modelagem de doenças.
Abstract
A doença renal afeta mais de 10% da população global e custa bilhões de dólares em gastos federais. As formas mais graves de doença renal e eventual insuficiência renal em estágio terminal são frequentemente causadas pelo dano aos podocitos glomerulares, que são as células epiteliais altamente especializadas que funcionam junto com células endoteliais e a membrana do porão glomerular para formar a barreira de filtragem do rim. Os avanços na medicina renal têm sido dificultados pela limitada disponibilidade de tecidos primários e pela falta de métodos robustos para a derivação de células renais humanas funcionais, como os podocitos. A capacidade de derivar podocitos de fontes renováveis, como células-tronco, poderia ajudar a avançar a compreensão atual dos mecanismos de desenvolvimento renal humano e doenças, bem como fornecer novas ferramentas para a descoberta terapêutica. O objetivo deste protocolo foi desenvolver um método para derivar podocitos maduros e pós-mitóticos de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS) com alta eficiência e especificidade, e sob condições quimicamente definidas. Os podócitos derivados de células hiPS produzidos por este método expressam marcadores específicos de linhagem (incluindo nefrina, podocina e tumor 1 de Wilm) e exibem as características morfológicas especializadas (incluindo processos de pé primário e secundário) associadas a podocitos maduros e funcionais. Curiosamente, essas características especializadas estão notavelmente ausentes na linha celular podocito imortalizada amplamente utilizada no campo, o que sugere que o protocolo descrito aqui produz podocitos renais humanos que têm um fenótipo de desenvolvimento mais maduro do que as linhas celulares podocyte existentes normalmente usadas para estudar biologia renal humana.
Introduction
Os avanços na cultura das células-tronco pluripotentes humanas estão prontos para revolucionar a medicina regenerativa, a modelagem de doenças e o rastreamento de medicamentos, fornecendo aos pesquisadores uma fonte renovável e escalável de material biológico que pode ser projetado para obter quase qualquer tipo de célula dentro do corpo humano1. Essa estratégia é especialmente útil para o derivado de tipos de células especializadas e funcionais que, de outra forma, seriam difíceis de obter. As células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS)células 2,3,4,5 são particularmente atraentes devido à sua origem celular somática e ao potencial que representam para a medicina personalizada. No entanto, o desenvolvimento de métodos para derivar outras linhagens celulares de células hiPS permanece desafiador devido ao uso frequente de condições culturais mal definidas que levam à baixa eficiência e geração não específica de populações de células heterogênios6,7.
Apresentado aqui é um método para a derivação de podocitos renais maduros de células hiPS com especificidade e alta eficiência em condições quimicamente definidas. Ao considerar os papéis de múltiplos fatores dentro do microambiente celular, desenvolveu-se uma estratégia de diferenciação de células-tronco que envolveu a otimização de fatores solúveis apresentados no meio da cultura celular, bem como fatores insolúveis, como componentes da matriz extracelular ou substratos adesivos. Dada a importância da sinalização integrin no desenvolvimento e função podocyte, a expressão de receptores integrin na superfície celular foi inicialmente examinada. β1 integrins foram altamente expressos não apenas em células hiPS, mas também em seus derivados, incluindo mesoderme e células intermediárias de mesoderme8,9,10. Experimentos subsequentes confirmaram que ligantes que se ligam a β1 integrinos (incluindo laminina 511 ou fragmento de laminina 511-E8) suportam a adesão e diferenciação das células hiPS em podocitos quando usados em conjunto com a mídia indutiva solúvel descrita abaixo.
A indução do compromisso de linhagem celular foi iniciada pela primeira vez confirmando que as células hiPS cultivadas nas superfícies revestidas de laminina por dois dias na presença de um meio contendo Activin A, CHIR99021 e Y27632 O inibidor de rocha pode se diferenciar em células que expressam os primeiros marcadores de mesoderme HAND1, goosecoid e brachyury8,11. O tratamento das células de mesoderme por 14 dias com um meio suplementado com proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) e CHIR99021 possibilitou a derivação de células intermediárias de mesoderme que expressavam os marcadores celulares nefrão-progenitor do Tumor 1 (WT1), proteína relacionada 1 (OSR1)8,11, e gene de caixa emparelhada 2 proteína (PAX2)12. Para derivar os podocitos glomerulares renais maduros, as células mesoderm intermediárias foram tratadas por 4-5 dias com um novo meio composto por BMP-7, Activin A, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ácido retinóicototalmente trans e CHIR99021. A citometria de fluxo e a imunossuagem foram utilizadas para confirmar que >90% das células resultantes apresentavam as características moleculares, morfológicas e funcionais do podocito renal maduro8,11,13. Essas características incluem o desenvolvimento de processos de pé primário e secundário; a expressão de genes específicos de linhagem podocyte, incluindo SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 e a expressão de proteínas incluindo podocina, nefrina e WT114,15,16. Além disso, verificou-se que os podocitos derivados de células hiPS podem ser mantidos na cultura por até quatro semanas in vitro usando um meiocomercialmentedisponível 8,11 que fornece uma flexibilidade adicional no tempo de experimentos a jusante. Para obter mais informações sobre os painéis de citometria de fluxo utilizados para determinar a pureza dos hiPS-podocytes, consulte nossa publicação anterior11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste relatório, descrevemos um protocolo para a geração de podocitos glomerulares renais a partir de células hiPS. Os podocitos derivados de células hiPS apresentam características morfológicas e moleculares associadas ao fenótipo de podocito renal maduro13. Em publicações anteriores, mostramos que os podocitos derivados de células hiPS podem imitar a estrutura e a função de filtragem seletiva do glomerulus renal quando co-cultivado com células endoteliais microvasculares glomerular…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Escola Pratt de Engenharia da Duke University, a Divisão de Nefrologia da Duke Medical School, um Prêmio de Pesquisa de Uma Cadeira do Departamento de Medicina da Duke University, e um Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award to S.M.. M.B foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação em Pesquisa da Fundação Nacional de Ciência. Agradecemos ao Laboratório Bursac por nos fornecer generosamente a linha de células-tronco DU11, e o Laboratório Varghese da Universidade duke por compartilhar temporariamente suas instalações de cultura de tecidos com nosso grupo. Esta publicação é dedicada à Profª Laura L. Kiessling, Novartis Professora de Química do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, em comemoração aos seus 60anos.
Materials
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T） | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
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