数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化
Summary
このプロトコルは、数百個の微生物細胞のAFM測定を自動化することを目的としています。まず、微生物をPDMSスタンプ微細構造に固定化し、次に何百もの固定化された細胞に対して力分光測定を自動的に行います。
Abstract
本論文では、バイオAFM実験と力曲線の記録を自動化することを目的とした方法を紹介します。この方法を使用すると、1000個のセル上の力のカーブを4時間に自動的に記録することができます。4時間の解析時間を維持するために、セルあたりの力曲線の数は9または16に減少する。このメソッドは、Jython ベースのプログラムと定義されたパターンでセルを組み立てる方法を組み合わせたものです。商用Bio-AFMに実装されたこのプログラムは、配列の最初のセルに先端を中央に配置し、各セルに力曲線を記録しながら自動的にセルからセルに移動することができます。この方法論を用いて、それらの剛性、接着特性などの細胞の生物物理学的パラメータにアクセスすることが可能である。自動化と多数のセルが分析された場合、セルの母集団の動作にアクセスできます。これは、データがこれまでに数十個の細胞に記録されているBio-AFM分野のブレークスルーです。
Introduction
この研究は、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて何百もの生きた細胞に対して自動力測定を行う方法を提供する。また、液体環境で行われたAFM実験と互換性のあるPDMSマイクロストラクチャードスタンプ上の微生物を固定化する方法も提供します。
バイオAFMは生物学の応用のために考案された高度に専門化された技術であり、その後、生きた細胞を研究するために使用されます。その時に1つの細胞を分析できる訓練を受けたエンジニアが必要です。これらの条件では、分析できる異なる細胞の数は、むしろ少なく、4〜5時間で典型的な5〜10個の細胞である。しかし、単一のセルに記録された力の量は通常非常に高く、簡単に1000に達することができます。したがって、現在の生細胞のAFM力測定のパラダイムは、数百の力曲線(FC)を記録するが、限られた数の細胞に記録する。
統計的には、このアプローチは疑わしく、サンプルの代表的な問題を提起します。実際、数百個の測定が数百個の細胞に記録されていても、例えば、数個の細胞のみを測定して細胞集団の不均一性を評価することは困難である。しかし、生物物理学、微生物学、ナノメディシン1、2、3において大きな進歩がなされたのはこのパラダイムに基づいています。実際、単一細胞の規模でのナノメートル分析は、細胞ナノメカニクスに関する新しい情報を提供し、膜貫通タンパク質の組織、または抗菌薬または抗癌剤の作用機構4、5、6、7を提供している。しかし最近、細胞に対して行われたいくつかのハイスループットバイオメカニカル試験が8に出現し、このパラダイムを変え、細胞集団の不均一性にアクセスすることに対する科学界の関心を示している。これらのテストはすべて、マイクロ流体システムに依存して細胞を変形させ、応力下での変形を光学的に測定して、表面全体の弾性8の間接的な尺度を得る。しかし、これらの方法の重要な問題は、それらがモノパラメトリックであるということです:唯一の細胞の弾力性をプローブすることができます。さらに、それらは、例えば非循環哺乳類細胞またはバイオフィルムの研究のために制限することができる接着細胞の機械的パラメータの測定を可能にしない。
AFMを含むアプローチは、S.シューリング9 とM.ファーヴル10のチームによって開発されました。Scheuringら. フィブロネクチンパターン9上の固定化細胞は、個々の細胞がパターン9の形状を取ることを強制する。その後、このチームは、14〜18個のセルを代表する平均データを定義するために、いくつかのセルの機械的特性をマッピングしました。Farveららによって行われた開発は、AFM片持ち10を並列化して測定値を多重化することを目的とした。私たちの知る限りでは、多重化方向のこの研究は、生きている細胞の測定につながっていません。
Dujardinのチームが提案した興味深いアプローチは、細胞を識別し、カスタムメイドの井戸の底でそれらをイメージングすることができる自動化されたAFMを提示します。この方法では、細胞の大規模な集団の分析を可能にしませんが、それは各ウェル11で異なる条件の自動テストを可能にします。
この研究における私たちの目的は、平均細胞ではなく、逆に細胞間の不均一性にアクセスするために少なくとも1000個の細胞を測定したかったので、より野心的です。ここで AFM を用いて細胞集団の不均一性にアクセスするために開発した戦略は、限られた数の力曲線が記録されている数百の細胞の分析に基づいています。限られた数のセルに多数の力曲線を記録する「古典的な」アプローチと比較して、このアプローチは同じ情報を提供しないので、補完的なものとして考慮されるべきです。実際、典型的な方法では個々の細胞表面の不均一性を探査することができますが、我々のアプローチを使用して、細胞集団全体の不均一性にアクセスすることができます。この目的を達成するために、微生物(ここでは酵母種 カンジダ・アルビカンス)をPDMSマイクロストラクチャースタンプ12の井戸に直接固定化する方法を組み合わせ、AFM先端を自動的に細胞から細胞13 に移動させ、各細胞の機械的特性を測定するオリジナルプログラムを開発しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法論によって提供される主な改善は、一定の時間で測定された細胞の数の有意な増加である。対応する値は、セル当たりのポイント数の減少です。これは、この方法が単一のセルの詳細な分析を提供するように設計されていないことを意味します。この方法は、PDMS スタンプのウェルに収まるセルにのみ適用されます。スタンプは非常に汎用性が高く、1.5 x 1.5 μm2 のウェルが 6 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、コナシト(メキシコ)、フランス外務省、パリ大学13のFONCYCYTを認めたいが、診断のためのナノ触診、No.263337(メキシコ)とMI5P02(フランス)と名付けられた国際的な共同ECOS-NORDプロジェクトの財政支援。AMRは、プロジェクトNo.20195489を通じてSIP-IPNの財政的支援に感謝したいと思います。SPCは、コチュテッレ契約を通じてCONACYT(288029第1)とIPNの博士課程のフェローシップによってサポートされ、二重PhD証明書(IPN-UPS)を取得します。EDとCFDは、センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック(CNRS)の研究者です。
Materials
| AFM cantilever | Bruker AFM probes | MLCT | The cantilevers used were the labeled “C” with resonant frequency of 7 to 10 kHz and k: 0.01 N/m |
| AFM data analysis | JPK-Bruker | JPK Data processing version minimum 5.1.8 | Can be downloaded from a JPK-Bruker user acount |
| AFM Petri dishes | WPI | FluoroDish FD35-100 | The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Atomic force Microscope (AFM) | JPK-Bruker | Nanowizard II or III | the AFM should be mounted on an inverted optical microscope with a motorized stage |
| Caspofungin | Sigma-Aldrich | SML0425-5MG | Caspofungin was used with a concentration of 4 MIC (Minimum Inhibitor Concentration) |
| Code editor | Microsoft | Visual Studio Code version 1.40.1 | https://code.visualstudio.com/ |
| Cryobeads | IFU | CB12 | |
| Dessicator/Degassing chamber | Fisherbrand | 15594635 | The equipment is used to degassing the PDMS stamps for about 50 minutes any dessicator coupled with a vaccum pump will do. |
| Petri dish heater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | This is an add-on to the JPK/Bruker AFM. The heater was used to monitor the temperature changes during the experiment |
| Sodium acetate buffer pH 5.2 | Sigma-Aldrich | S7899 | The solution contains 18 mM sodium acetate, 1 mM CaCl2, and 1 mM MnCl2. Adjust the pH with glacial acetic acid. The solution can be stored at 4 °C for 2 months |
| Statistical analysis language | https://www.r-project.org | R version 3.6.1 | R is a language and environment for statistical computing and graphics. It is a GNU project which is similar to the S language and environment |
| Statistical analysis software | https://rstudio.com | R studio version 1.1.463 | collaboration between the R Foundation, RStudio, Microsoft, TIBCO, Google, Oracle, HP and others. RStudio and Shiny are affiliated projects of the Foundation for Open Access Statistics |
| Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028 | Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent in one set |
| Yeast Peptone D Broth | Difco | 242820 | |
| YPD Agar | Difco | DF0427-17-6 |
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