Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è mostrare l’assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un’eccellente bioattività nell’incoraggiare l’adesione degli HMSC.

Abstract

Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l’ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l’auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.

La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un’eccellente piattaforma per migliorare l’adesione hMSC. L’analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l’ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.

Introduction

Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti¹. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico². hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l’angiogenesi e riducendo l’infiammazione³. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l’efficienza per gli hMSC di raggiungere un tessuto bersaglio e funzionare nella posizione desiderata è bassa⁴. Sebbene varie impalcature ingegnerizzate siano state utilizzate per attirare gli HMSC ad aderire alle lesioni, alcuni siti come la frattura della piastra di crescita, nel mezzo di un osso lungo, non sono facilmente accessibili dalle impalcature prefabburate convenzionali, che potrebbero non adattarsi perfettamente a un sito ferito di forma irregolare.

Qui, abbiamo sviluppato un nanomateriale biomimetico che può auto-assemblarsi in situ ed essere iniettato in un’area bersaglio difficile da raggiungere. La bio-impalcatura iniettabile NM è composta da nanotubi di base janus (JBNT) e fibronectina (FN). I JBNT, noti anche come Nanotubi di Rosetta (RTT), derivano da coppie di basi di DNA, in particolare timina e adenina,^{qui 5,6,7}. Come si vede nella Figura 1, i nanotubi si formano quando sei molecole delle coppie di basi di DNA derivate si auto-assemblano tramite legami idrogeno per formare un^{piano 6}. Sei molecole vengono quindi impilate l’una sull’altra in un piano attraverso una forte interazione di pi-stacking⁷, che può essere lunga fino a 200-300 μm. I JBNT sono progettati per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN reagisca con loro.

FN è una glicoproteina adesiva ad alto peso molecolare, che può essere trovata nella matrice extracellulare (ECM)⁹. Questi possono mediare l’attaccamento delle cellule staminali ad altri componenti dell’ECM, in particolare^{collagene 10}. Abbiamo progettato JBNT per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN possa reagire con loro per formare la MN in pochi secondi attraverso il legame non covalente. Pertanto, la MN è una promettente bio-impalcatura da iniettare in un sito di frattura ossea che non potrebbe essere accessibile dalle impalcature fabbricate convenzionalmente. Qui, la MN iniettabile presenta un’eccellente capacità di migliorare l’ancoraggio hMSC in vitro, esibendo il loro potenziale di servire come impalcatura per la rigenerazione dei tessuti.

Protocol

1. Sintesi dei JBNT NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11. Sintesi del composto A1 Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore. Raffreddare la miscela di reazione a temperatura amb…

Representative Results

I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultr…

Discussion

In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell’acqua al posto del PBS perché pbs causerà l’agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre not…

Materials

1,2-dichloroethane	Alfa Aesar	39121
2-cyanoacetic acid	Sigma-Aldrich	C88505
4-Dimethylaminopyridine	TCI America	D1450
8 wells Chambered Coverglass	Thermo Fisher	155409
96-well plate	Corning	353072
absolute ethanol	Thermo Fisher	BP2818500
acetone	Sigma-Aldrich	179124
acetonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC32G
citric acid	Sigma-Aldrich	251275
concentrated hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Deionized water	Thermo Fisher	15230147
dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997
diethyl ether	Sigma-Aldrich	296082
Di-tert-butyl dicarbonate	Sigma-Aldrich	361941
ethyl acetate	Sigma-Aldrich	319902
ethylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectin	Thermo Fisher	PHE0023
Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)	Thermo Fisher	R37814
guanidinium hydrochloride	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Human mesenchymal stem cells	Lonza	PT-2501
methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl iodide	Sigma-Aldrich	289566
N,N-Diisopropylethylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-dimethylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-Methylmorpholine N-oxide	Alfa Aesar	A19802
Osmium tetraoxide	Alfa Aesar	45385
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140163
Phosphate Buffer Solution	Thermo Fisher	20012050
phosphoryl chloride	Sigma-Aldrich	201170
potassium carbonate	Sigma-Aldrich	347825
reverse phase column	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloidin	Thermo Fisher	R415
silica gel	TCI America	S0821
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
sodium ethoxide	Alfa Aesar	L13083
sodium periodide	Sigma-Aldrich	71859
sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313
sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505
sodium triacetoxyborohydride	Alfa Aesar	B22060
spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluene	Sigma-Aldrich	179418
triethylamine	Alfa Aesar	A12646
trifluoroacetic acid	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher	25200056