تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

Summary

نقدم هنا بروتوكولا للعزل في المختبر لمجموعات الخلايا الدبقية المتعددة من الجهاز العصبي المركزي للفأر. تسمح هذه الطريقة بفصل الخلايا الدبقية الصغيرة الإقليمية ، وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن ، والخلايا النجمية لدراسة الأنماط الظاهرية لكل منها في مجموعة متنوعة من أنظمة الثقافة.

Abstract

توضح الطرق المعروضة هنا الإجراءات المختبرية لتشريح أربع مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) من حديثي الولادة الفئران لعزل المجموعات السكانية الدبقية. الغرض من هذا الإجراء هو فصل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا السلفية قليلة التغصن (OPCs) والخلايا النجمية من الأنسجة القشرية والمخيخية وجذع الدماغ والحبل الشوكي لتسهيل المزيد من التحليل في المختبر. تسمح إجراءات عزل منطقة الجهاز العصبي المركزي بتحديد عدم التجانس الإقليمي بين الخلايا الدبقية في أنظمة زراعة الخلايا المتعددة. يتم إجراء عزل سريع لمنطقة الجهاز العصبي المركزي ، يليه الإزالة الميكانيكية للسحايا لمنع تلوث الخلايا السحائية من الخلايا الدبقية. يجمع هذا البروتوكول بين تفكك الأنسجة اللطيف والطلاء على مصفوفة محددة مصممة للحفاظ على سلامة الخلايا والتصاق. يوفر عزل الخلايا الدبقية المختلطة من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة تحليلا شاملا للخلايا الدبقية التي يحتمل أن تكون غير متجانسة مع تعظيم استخدام التجارب الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تفكك الأنسجة الإقليمية ، تنقسم الخلايا الدبقية المختلطة إلى أنواع متعددة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة ، و OPCs ، والخلايا النجمية لاستخدامها إما في نوع الخلية المفردة ، أو إدراج لوحة زراعة الخلايا ، أو أنظمة الاستزراع المشترك. بشكل عام ، توفر التقنيات الموضحة بروتوكولا شاملا للتطبيق الواسع للتشريح الدقيق لأربع مناطق فردية من الجهاز العصبي المركزي من حديثي الولادة الفئران وتتضمن طرقا لعزل ثلاثة أنواع فردية من الخلايا الدبقية لفحص عدم التجانس الإقليمي في أي عدد من أنظمة أو فحوصات زراعة الخلايا في المختبر.

Introduction

الدبقية ضرورية للوظيفة العصبية المناسبة في الجهاز العصبي المركزي. وهي تتألف من ثلاث مجموعات فرعية رئيسية ، الخلايا النجمية ، والخلايا قليلة التغصن ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، ولكل منها دور مختلف ، ولكنه لا غنى عنه¹. بدون تنوع الخلايا الدبقية المناسبة ونشاطها ، ستتأثر وظيفة الخلايا العصبية بشدة ، مما يؤدي إلى ضعف الجهاز العصبي المركزي. الدبقية قادرة على التأثير على النقل العصبي ، وكل نوع من الخلايا يفعل ذلك بطريقة فريدة. الخلايا الدبقية في الدماغ لديها القدرة على التواصل فيما بينها ، وكذلك مع الخلايا العصبية ، من أجل تسهيل وظيفة الجهاز العصبي المركزي^{المناسبة 2}. تزيد الخلايا قليلة التغصن من سرعة النقل الكهربائي من خلال تكوين غمد المايلين ، مما يسهل تجميع القنوات الأيونية في عقد رانفييه ، مواقع توليد إمكانات الفعل العصبي³. تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة ضرورية لتقليم نقاط الاشتباك العصبي من خلال مراقبة الانتقال المشبكي و “إعادة توصيل” الوصلات العصبية بعد الإصابة⁴. بالإضافة إلى ذلك ، تعد الخلايا الدبقية الصغيرة أكثر الخلايا المناعية المقيمة وفرة في الجهاز العصبي المركزي ، حيث تعمل كشكل أساسي للدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض⁵. يمكن للخلايا النجمية تنظيم الانتقال المشبكي بين الخلايا العصبية عن طريق تعديل تركيز البوتاسيوم خارج الخلية⁶. لديهم أيضا أدوار في التحكم في تدفق الدم المحلي⁷ ، وإطلاق وتناول العناصر المعدلة للأعصاب⁸ ، ولها دور رئيسي في الحفاظ على حاجز الدم في الدماغ⁹. وبالتالي ، فإن كل نوع فرعي دبقي أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز العصبي المركزي ، حيث ترتبط العيوب في أي نوع منذ فترة طويلة بمجموعة واسعة من الحالات المرضية ، بما في ذلك الأمراض النفسية والصرع والحالات التنكسية العصبية¹⁰.

أكبر عقبة في دراسة علم الأمراض في الجهاز العصبي المركزي هي عدم القدرة على التحقيق في الخلايا البشرية في سياق مكانتها البيئية الدقيقة. يتم جمع أنسجة الخزعة البشرية بعد الوفاة ويمكن بسهولة أن تتلف الخلايا أو تضيع أثناء الاستخراج والمعالجة. علاوة على ذلك ، من الصعب الحفاظ على الخلايا البشرية حية وقابلة للحياة في المختبر لأي فترة زمنية دون اشتقاق خطوط الخلايا الخالدة من الأورام ، وعند هذه النقطة لم تعد تعكس بدقة خصائصها الفسيولوجية الطبيعية^11,12. بالإضافة إلى ذلك ، هناك قدر كبير من عدم التجانس الإقليمي بين أنواع الخلايا الدبقية الفردية¹³،¹⁴،^{15 ،} والحصول على عينات الجهاز العصبي المركزي الإقليمية من المرضى الفرديين يكاد يكون مستحيلا. على هذا النحو ، من الضروري تطوير نماذج بديلة لدراسة مساهمة الخلايا الدبقية الإقليمية في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي المحددة.

هنا ، نصف نظاما في المختبر باستخدام عزل منطقة الجهاز العصبي المركزي للفأر للعديد من المجموعات الفرعية الدبقية ، مما يسمح بمعالجة وتحديد كمية الخلايا الدبقية الصغيرة ، وخلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) ، والتي تؤدي إلى ظهور خلايا قليلة التغصن الناضجة ، والخلايا النجمية. يمكن عزل كل مجموعة بشكل مستقل وإخضاعها لمجموعة واسعة من التقنيات التجريبية بما في ذلك العلاج بالأدوية أو الجزيئات ، والكيمياء المناعية ، واستخراج وتحليل البروتين / الحمض النووي الريبي ، وأنظمة الاستزراع المشترك الأخرى اعتمادا على الضرورة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، تنتج تقنية العزل هذه عددا كبيرا من الخلايا ، مما يسمح بتوصيف وفحص كل مجموعة دبقية بطريقة عالية الإنتاجية. كما أنه يتيح دراسة تمايز خلايا الجهاز العصبي المركزي ونموها وانتشارها استجابة لمجموعة واسعة من المحفزات البيئية الدقيقة بطريقة خاضعة للرقابة من أجل تجنب العوامل المربكة التي توجد عادة في بيئة الجسم الحي. وأخيرا، تسهل تقنية عزل الخلايا هذه التلاعب بمجموعات الخلايا الدبقية داخل مناطق الجهاز العصبي المركزي المختلفة للتحقيق في كيفية تفاعل الخلايا الدبقية الإقليمية مع بعضها البعض والاستجابة للمحفزات المختلفة، مما يسمح بالدقة والتكاثر.

Protocol

ملاحظة: تم اعتماد جميع الدراسات على الحيوانات والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان التابعة لمعهد كليفلاند كلينك ليرنر. 1. إعداد وسائل الإعلام واللوازم للتشريح ملاحظة: يتم توفير جميع وصفات المخزن المؤقت والوسائط في الجدول 1. يتم هذا الإجراء في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية المخصصة لزراعة الأنسجة. تحضير وتعقيم تصفية وسائط الخلايا الدبقية المختلطة (MGM). يمكن القيام بذلك في اليوم السابق وتخزينه في 4 درجات مئوية. تمييع الفبرونيكتين بتركيز 1: 100 مع H2O المعقم. يعتمد حجم الفبرونيكتين المخفف على عدد الجراء ومنطقة الجهاز العصبي المركزي المستخدمة في التجربة. استخدم دورق T25 واحد لقشرة واحدة ، وقارورة T25 واحدة ل 2-4 سيريبيلا ، ودورق T25 واحد ل 2-4 سيقان دماغية ، ودورق T25 واحد ل 2-4 حبال نخاعية.ملاحظة: سيسمح الجمع بين الأنسجة من نفس المنطقة باستخدام المعايير المذكورة أعلاه بالتفكك الكافي دون تغيير البروتوكول الموضح أدناه. سيتطلب الجمع بين أنسجة أكثر مما هو موصوف في الخطوة 1.2 مزيدا من التحسين لتركيزات كاشف التفكك. ماصة 3 مل من الفبرونيكتين المخفف في قوارير T25 في درجة حرارة الغرفة والسماح للجلوس لمدة 2 دقيقة. استنشاق الفبرونيكتين واترك القوارير تجف طوال الليل مع فك غطاء القارورة. 2. تشريح القشرة والمخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي ملاحظة: يمكن إجراء هذا الإجراء على سطح الطاولة ويتطلب منظار تشريح. استخدم تقنية معقمة صارمة لجميع خطوات الإجراء وقلل من تعرض الأنسجة لهواء الغرفة. حافظ على برودة جميع الوسائط على الثلج أثناء التشريح لضمان أقصى قدر من الحفاظ على الأنسجة. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء هذا الإجراء في غطاء يسمح باستخدام نطاق تشريح داخلي. امسح جميع المناطق بنسبة 70٪ إيثانول. ماصة 10 مل من محلول PBS / مضاد حيوي (PAS) في طبق بتري 10 سم. تحضير طبق بتري واحد لكل جرو ليتم تشريحه. يوضع على الثلج للحفاظ على المحلول باردا. في غطاء زراعة الأنسجة المطهر ، ماصة 9 مل من DMEM (بدون إضافات) في 4 أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 مل ، واحدة لكل منطقة من مناطق الجهاز العصبي المركزي ، واستبدل أغطية الأنابيب ، وضعها على الثلج. ضع دلو الثلج مع الأنابيب على مسافة قريبة من نطاق التشريح. ضع طبق بتري 10 سم محضر في الخطوة 2.2 في مرحلة منظار التشريح المطهر. تخدير وقتل الجرو الفأر وفقا للبروتوكول المؤسسي وإزالة الرأس عن طريق قطع الرأس السريع بمقص حاد.ملاحظة: يوم ما بعد الولادة (P) يتم استخدام 3-5 الجراء. الجراء الأكبر سنا لديهم الجهاز العصبي المركزي الأكثر تطورا وقد لا يكون مصدرا كافيا لتوسيع الخلايا الدبقية. قد ينتج عن الجراء الأصغر سنا (P) 0-2 عدد أكبر من الدبقية ويمكن استخدامها ؛ ومع ذلك ، من الصعب جدا تشريح أنسجة الحبل الشوكي في هذه السن المبكرة بسبب الحجم. نظف جلد الجرو باستخدام 70٪ إيثانول. باستخدام مقص ناعم ، قم بقطع الطبقة الجلدية على طول خط الوسط لرأس الحيوان ، بدءا من ذيليا وتحريك المنبر ، حتى الوصول إلى الخطم. تجنب القطع بعمق في الجمجمة لتجنب أي تلف في الأنسجة. بتحريك الرأس لأسفل ، اسحب الطبقة الجلدية إلى كل جانب من جوانب الجمجمة وباستخدام مقص الربيع ، قم بعمل شق على طول خط وسط الجمجمة ، بدءا من الثقبة العظمى ، وقطع الذيلية مرة أخرى إلى المنضدة. باستخدام ملقط رفيع الرأس ، اسحب نصفي الجمجمة إلى الجانبين الأيمن والأيسر ، مما يعرض القشرة والمخيخ وجذع الدماغ. بمجرد التعرض ، ارفع الدماغ برفق من الجمجمة إلى طبق بتري 10 سم المحضر في الخطوة 2.2. تأكد من بقاء الدماغ غير تالف للحفاظ على البنية التشريحية ، مع توصيل الدماغ الخلفي. باستخدام ملقط رفيع ذو رأس منحني مع توجيه نقطة الملقط لأعلى ، اضغط على المخيخ. قم بإزالة السحايا وضعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في دلو ثلج. تأكد من أن جذع الدماغ بطني مباشرة إلى المخيخ ويكون مرئيا بعد إزالة المخيخ. قم بإزالته بملقط ذو رؤوس دقيقة ، وقم بإزالة السحايا ، وضعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في دلو ثلج. افصل الدماغ المتوسط عن القشرة ، وقم بإزالة السحايا القشرية ، وضعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في دلو ثلج. لإزالة الحبل الشوكي ، ضع جرو الفأر مقطوع الرأس في وضع ضعيف (مستلقيا لأعلى) مع رفع العمود الفقري المقطوع نحو المحقق. رش مرة أخرى مع 70 ٪ من الإيثانول. قطع على طول الجوانب الجانبية للعمود الفقري ، في اتجاه منبر إلى الذيلية ، من خلال القفص الصدري حتى الوصول إلى الأطراف الخلفية. أثناء القطع ، ادفع الأعضاء الداخلية للخلف حتى يصبح العمود الفقري مرئيا. تقطع على طول كل جانب جانبي من العمود الفقري حتى يتم عزله وتوضع في طبق بتري 10 سم المحضر في الخطوة 2.2. مع الجانب البطني لأعلى ، باستخدام مقص زنبركي ناعم ، قم بالتناوب على قطع الجانبين الأيمن والأيسر لكل فقرة حتى الوصول إلى منطقة أسفل الظهر لكشف أنسجة الحبل الشوكي. قم بإزالة الحبل الشوكي والسحايا برفق باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة تحت مجهر التشريح. ضع في أنبوب مخروطي 15 مل في دلو الثلج. كرر الخطوات 2.5.-2.19 لكل جرو ، مع الجمع بين الأنسجة من نفس المنطقة لتناسب المعايير الموضحة في الخطوة 1.2 لكل دورق T25 معد.ملاحظة: إزالة السحايا تماما قدر الإمكان. إذا بقيت كمية كبيرة من السحايا ، فإن النمط الظاهري الشبيه بالخلايا الليفية للخلايا السحائية سوف يتفوق ويطغى على ثقافة الخلايا. يمكن الجمع بين الحبال الشوكية المتعددة ، ذات النمط الظاهري المتساوي ، من أجل توليد ثقافة خلية معينة. احرص على التأكد من عدم حدوث اكتظاظ الخلايا ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج الدبقي والأنماط الظاهرية التفاضلية. 3. تفكك الأنسجة ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الإجراءات التالية في خزانة السلامة الحيوية المخصصة لزراعة الأنسجة المعقمة باستخدام تقنية معقمة ومواد معقمة. أضف 1 مل من 0.05٪ تربسين يحتوي على 0.53 mM EDTA إلى كل أنبوب مخروطي سعة 15 مل من 9 مل DMEM والأنسجة لبدء تحلل الأنسجة.ملاحظة: يحتوي DMEM على كمية عالية من كلوريد الكالسيوم ، والذي يمكن أن يعمل كمثبط للتربسين. إذا لم يكتمل التفكك باتباع الخطوات الموضحة ، فيمكن استخدام محلول الملح المتوازن من هانكس بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد التربسين ، يمكن تحييد الإنزيم عن طريق إضافة مثبط التربسين ، على الرغم من أنه يجب إضافة الكالسيوم مرة أخرى إلى المحلول لأنه عامل مساعد ل DNase I ، والذي يستخدم في الخطوات اللاحقة. نسج مع ماصة 10 مل حوالي 20x. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية فارغة سعة 50 مل. احتضان المحلول عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 15 دقيقة ، مع تحريك المحللات برفق بعد 8 دقائق. أضف 5 مل من MGM و 200 ميكرولتر (5 مجم / مل) DNase I إلى كل أنبوب للحصول على تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / مل. نسج كل محللة مع ماصة 10 مل 10x. دع معلقات الخلية تجلس لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للأنسجة غير المنفصلة بالاستقرار في قاع الأنابيب. انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 50 مل ، تاركة وراءها الأنسجة غير المنفصلة.ملاحظة: خطوات التحلل والتثليج الموصوفة أعلاه تحد بشكل كبير من كمية الأنسجة غير المنفصلة. أجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية بدون فرامل. نضح المادة الطافية وإعادة تعليق كريات الخلايا المتبقية في 5 مل من MGM. سحن الحبيبات باستخدام ماصة 5 مل 20x. قم بطلاء معلقات الخلايا سعة 5 مل على قوارير T25 المطلية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 وتغيير الوسائط في البداية بعد 24 ساعة لإزالة حطام الخلية.ملاحظة: توصي بعض البروتوكولات بتغيير الوسائط الأولي بعد 72 ساعة. قد يكون تحسين هذه الخطوة مطلوبا. قم بإجراء تغيير وسائط بنسبة 100٪ باستخدام MGM كل 48-72 ساعة حتى تصبح الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ (حوالي 5-7 أيام).ملاحظة: يجب تسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل تغيير الوسائط. 4. عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بمجرد أن تصل ثقافات الخلايا الدبقية المختلطة إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بإعداد قوارير للاهتزاز عن طريق شد الأغطية والختم بفيلم البارافين. لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من الثقافات الدبقية المختلطة ، قم بتأمين القوارير أفقيا على شاكر مداري داخل حاضنة 37 درجة مئوية. هز قوارير في 15 × غرام لمدة 1 ساعة. قم بإزالة الوسائط والماصة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. شطف القوارير مرتين مع 3 مل MGM الدافئة ، إضافة الغسيل إلى الأنابيب المخروطية 15 مل. هذه هي الخلايا الدبقية الصغيرة. أضف 5 مل من MGM الدافئ والطازج إلى قوارير الثقافة. أعد إغلاق القوارير بغشاء البارافين ، وقم بتأمين القوارير أفقيا على شاكر ، ورجها عند 15 × جم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة لفصل OPCs عن الخلايا النجمية.ملاحظة: يمكن القيام بهذه الخطوة بين عشية وضحاها ، ولكن وقت الاهتزاز لمدة 15 ساعة أمر بالغ الأهمية لأن الوقت الزائد قد يؤدي إلى موت الخلايا. جهاز طرد مركزي للطافي من الخطوة 4.3. عند 300 × جم لمدة 3 دقائق وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة وفقا للبروتوكولات القياسية16 أو استخدامها للفحص البيولوجي. 5. عزل خلية السلائف قليلة التغصن ملاحظة: عند طلاء OPCs بعد العزل الأولي ، يجب أن تكون مطلية على سطح مطلي ببولي D-ليسين (لوحة معقمة أو زلة غطاء). قم بإعداد هذه المواد قبل الانتهاء من هذا القسم. بعد الهز لمدة 15 ساعة ، أخرج المادة الطافية من القوارير وقم بوضعها على طبق بتري معقم مقاس 100 مم. احتضان المادة الطافية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة ، مع الدوران بعد 15 دقيقة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة المتبقية ، لأنها سوف تلتصق بسرعة كبيرة بالطبق. يمكن استخدام أطباق بتري غير المعالجة بزراعة الأنسجة لهذه الخطوة. قم بإزالة طافية الخلايا غير الملتصقة ، والعد ، واللوحة على سطح مطلي ببولي دي ليسين. عادة ، يتم طلاء 7,500-10,000 OPCs / سم2. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة على الأقل (حتى 6 ساعات) ، ثم استنشاق 95٪ من الوسائط برفق ، وإضافة OPC Media الدافئ ببطء ، وسحب الوسائط على جدار البئر لتقليل تعطيل OPCs. قم بتغيير الوسائط كل 48 ساعة حتى تصبح الخلايا جاهزة للاستخدام.ملاحظة: من الأهمية بمكان أن يتم تغيير بئر واحد فقط في كل مرة. OPCs حساسة ولا تتحمل بشكل خاص الظروف الجافة. تؤدي إضافة PDGF-AA في وسائط OPC إلى تأخير نضوج OPC إلى خلايا قليلة التغصن. يمكن استبعاد هذا العامل من وسائط الاستزراع إذا كان التركيز التجريبي هو الخلايا قليلة التغصن الناضجة. 6. عزل الخلايا النجمية بعد 15 ساعة من الهز ، قم بإزالة القوارير الطافية وشطف القوارير 2x باستخدام برنامج تلفزيوني دافئ 1x. أضف 4 مل من 0.05٪ تربسين يحتوي على 0.53 مللي مول EDTA واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق أو حتى ترفع الخلايا. لضمان رفع الخلايا النجمية ، تصورها باستخدام مجهر قياسي واسع المجال. ستظهر الخلايا النجمية كروية بعد التربسين. بمجرد انفصال الخلايا النجمية ، قف دورق عموديا وأضف 4 مل MGM. سحن لخلط. ماصة الخلايا النجمية في أنبوب مخروطي 15 مل ، جهاز طرد مركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الخلايا النجمية في وسائط الخلايا النجمية واللوحة على السطح المطلي بالفبرونيكتين كما هو موضح في الخطوة 1.2. أو استخدامها للفحص البيولوجي.ملاحظة: يمكن إضافة عامل نمو الخلايا الليفية للفأر 20 نانوغرام / مل أثناء التغيير الإعلامي الأول للمساعدة في إنشاء ثقافة الخلايا النجمية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون طلاء الجيلاتين القياسي بديلا منخفض التكلفة للفيبرونيكتين. 7. تحديد وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، OPCs ، الخلايا النجمية ، والخلايا قليلة التغصن الناضجة باستخدام الكيمياء المناعية بمجرد وصول الخلايا المطلية إلى نقطة التقاء مناسبة ، قم بإزالة الوسائط برفق وإصلاح الخلايا الملتصقة باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق. قم بهذه الخطوة في خزانة السلامة البيولوجية.ملاحظة: عند شفط أو إضافة محاليل ، ماصة مع ضغط لطيف لمنع انفصال الخلية. قم بشفط PFA ببطء ثم اغسل الخلايا 3x مع 1x PBS لمدة 5 دقائق. قم بإعداد محلول الحجب المناسب باستخدام مصل 10٪ و 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS.ملاحظة: يعكس مصدر المصل الحيوان المضيف الذي نشأ فيه الجسم المضاد الثانوي. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الثانوي هو الماعز المضاد للأرنب ، فإن مصل الحجب المناسب هو مصل الماعز الطبيعي. وبالمثل ، إذا كان الجسم المضاد الثانوي هو حمار مضاد للأرنب ، فيجب أن يكون مصل الحجب مصل حمير طبيعي. أضف محلول الحظر حتى يتم تغطية الخلايا بالكامل. كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تحضير محلول مخفف للأجسام المضادة (9 مل من 1x PBS ، 0.01 جم من ألبومين مصل الأبقار ، 30 ميكرولتر Triton X-100). بدلا من ذلك ، يمكن تخفيف الأجسام المضادة في محلول الحجب الموضح في الخطوة 6.3. تمييع الأجسام المضادة الأولية الخاصة بما يلي في محلول مخفف أو مانع للأجسام المضادة:الخلايا الدبقية الصغيرة: جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 (Iba1) عند تخفيف 1: 250 (2.4 ميكروغرام / مل). OPCs: مستضد عصبي / دبقي 2 (NG2) عند تخفيف 1: 200 (5 ميكروغرام / مل). الخلايا قليلة التغصن الناضجة: بروتين المايلين الأساسي (MBP) عند تخفيف 1: 400 (التركيز يعتمد على الكثير وقد يكون التحسين ضروريا). الخلايا النجمية: البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) عند تخفيف 1: 400 (0.25 ميكروغرام / مل)17.ملاحظة: لا تخلط الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في نفس النوع.ملاحظة: سيقوم GFAP بتسمية الخلايا النجمية للمادة البيضاء بشكل موثوق. بالنسبة للخلايا النجمية للمادة الرمادية ، قد يلزم استخدام علامة بديلة. احتضان الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية (مع التحريض اللطيف هو الأفضل). اغسل 3x مع 1x PBS لمدة 5 دقائق لإزالة الجسم المضاد الأساسي. احتضان الخلايا بأجسام مضادة ثانوية مناسبة بتخفيف 1: 400 في مخفف الأجسام المضادة أو محلول مانع محمي من الضوء.ملاحظة: يتم اقتران الأجسام المضادة الثانوية بالفلوروفور الذي يمكن تبادله اعتمادا على معلمات المجهر المتاحة. بمجرد تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية ، احمها من الضوء قدر الإمكان. احتضان الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، والحد من التعرض للضوء. اغسل 3 مرات باستخدام 1x PBS لمدة 5 دقائق لإزالة الأجسام المضادة الثانوية الزائدة. لتسمية النوى ، استخدم محلول DAPI / PBS 1: 1,000 واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. اغسل 3x مع 1x PBS لمدة 5 دقائق في الظلام. للتركيب ، ضع وسائط التثبيت واتركها تجف في الظلام قبل التصوير.ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح المثبتة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام. للتخزين على المدى الطويل ، انقل الشرائح إلى 4 درجات مئوية. صورة في غضون أسبوع واحد للحصول على أقصى إشارة. تم تصوير جميع الصور التمثيلية على مجهر متحد البؤر ؛ ومع ذلك ، يوصى أيضا باستخدام مجاهر الفلورسنت المقلوبة.

Representative Results

توضح البيانات التمثيلية الموضحة أدناه أن إشارات IFNγ تؤثر على تمايز OPC ونضجه. بدون وجود مستقبلات IFNγ (IFNγR) ، لا تتمايز OPCs القشرية إلى خلايا قليلة التغصن الميالينية الناضجة بسهولة ، وهو ما يتضح من عدم وجود تلطيخ MBP (الشكل 1). نظرا لأن الخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية مشتقة من سلف شائع ، فقد قمنا بتحليل تعبير GFAP ، الذي يسمي الخلايا النجمية. وجدنا أن الخلايا التي تعاني من نقص IFNγR تعبر بقوة عن GFAP مما يشير إلى أنها قد تتبنى نمطا ظاهريا نجميا ، مما يؤكد التقارير السابقة19. يتضح دليل إضافي على عدم التجانس الإقليمي في خلايا الجهاز العصبي المركزي من خلال اختلاف مورفولوجيا الخلايا النجمية كما هو موضح في الخلايا النجمية من القشرة والمخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي (الشكل 2). تجدر الإشارة إلى أن الخلايا النجمية من نفس المنطقة قد تظهر أيضا عدم تجانس مورفولوجي ، مما يدعم فكرة أن هذا النوع الفرعي الدبقي ديناميكي للغاية. تشير الاختلافات في البنية الخلوية إلى التنوع الوظيفي ، وبالتالي فإن القدرة على عزل المجموعات الدبقية ضرورية لدراسة استجابات النمط الظاهري في غياب ووجود محفزات البيئة الدقيقة. تعتبر الخلايا قليلة التغصن ضرورية لتكوين الميالين في المحاور العصبية وهي ضرورية لإصلاح الجهاز العصبي المركزي ووظيفته بشكل صحيح. تؤدي OPCs إلى ظهور نظيراتها الناضجة ، مما يجعل من الأهمية بمكان فهم البيولوجيا الكامنة وراء قدرتها على التمايز. تؤثر إشارات السيتوكين بشكل كبير على سلوك الخلايا الجذعية والمناعية. وبالتالي ، من المهم أن نفهم كيف يمكن أن تختلف الاستجابات الإقليمية ل OPCs لتحفيز السيتوكينات التفاضلي (الشكل 3) ، مما قد يؤثر على قدرتها على التمايز إلى خلايا قليلة التغصن الميالينية الناضجة. الشكل 1: بيانات تمثيلية توضح تمايز OPC في الفئران WT و IFNγR-/- في وجود IFNγ خارجي. تم عزل OPCs القشرية من ( A ) WT و (B) IFNγR-/- P4 الفئران الجرو باتباع الإجراء الموضح أعلاه. عولجت الخلايا ب 1 نانوغرام / مل IFNγ لمدة 48 ساعة ، ثم تم تثبيتها وتلطيخها لتحديد تمايز الخلايا. تم تصنيف OPCs ل NG2 و GFAP لتحديد تلك التي كانت تتبنى النمط الظاهري النجمي. وبالمثل ، تم تصنيف OPCs أيضا ل NG2 و MBP لتحديد تلك التي كانت تتمايز إلى خلايا قليلة التغصن الناضجة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: بيانات تمثيلية توضح عدم التجانس الإقليمي في مورفولوجيا الخلايا النجمية. تم عزل الخلايا النجمية من القشرة والمخيخ وجذع الدماغ والحبل الشوكي من جراء الفئران P4 باستخدام البروتوكول الموصوف أعلاه وتم تصنيفه ل GFAP (الأخضر) بواسطة الكيمياء المناعية بعد 48 ساعة في الثقافة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: بيانات تمثيلية توضح الاستجابات التفاضلية ل OPCs الإقليمية للسيتوكينات. تم عزل OPCs من جذع الدماغ والحبل الشوكي لجراء الفئران P4 باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه. تمت معالجة الخلايا بتركيزات متزايدة (1-10 نانوغرام / مل) من ( A ) IFNγ أو (B) إنترلوكين (IL) -17 من أجل التحقيق في التأثير التفاضلي للسيتوكين على قدرة OPCs الإقليمية على التمايز إلى خلايا قليلة التغصن الميالينية. بعد حضانة 48 ساعة مع السيتوكينات المحددة ، تم إصلاح OPCs ووضع علامة على NG2 (أخضر) و MBP (أحمر). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. تمثل البيانات الوسائل ± SEM. ** ، p < 0.01 ؛ ، ص < 0.001 ؛ ، p < 0.0001 بواسطة 2-way ANOVA. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. برنامج تلفزيوني / محلول مضاد حيوي (PAS): 1.0 مل 100X مضاد حيوي / مضاد حيوي يحتوي على 10000 وحدة / مل بنسلين و 10000 مجم / مل ستربتومايسين 25 ملغم / مل أمفوتريسين ب 99 مل 1X برنامج تلفزيوني وسائل الإعلام الدبقية المختلطة (MGM) 88 مل 1X DMEM (ارتفاع الجلوكوز ، ث / L- الجلوتامين ، ث / نا بيروفات) 10 مل FBS المعطل بالحرارة 1.0 مل إل-جلوتامين (100X) 1.0 مل مضاد حيوي / مضاد حيوي OPC الوسائط (50 مل) 49 مل الوسائط العصبية القاعدية 1.0 مل ملحق B27 (50X) 10 نانوغرام/مل PDGF-AA ملاحظة: تتم إضافة PDGF-AA طازجة قبل كل تغيير في الوسائط. وسائط الخلايا النجمية (1 لتر) 764 مل MEM مع أملاح إيرل التي تحتوي على الجلوتامين 36 مل الجلوكوز (استخدم مخزون 100 مجم / مل للتركيز النهائي البالغ 20 مللي مول) 100 مل FBS المعطل بالحرارة 100 مل مصل الحصان المعطل بالحرارة 10 مل الجلوتامين (استخدم مخزون 200 مللي مول إذا لم يتم تضمينه في وسط المخزون) اختياري: 10 نانوغرام / مل عامل نمو بشرة الفأر المؤتلف ملاحظة: قم بتصفية جميع الوسائط وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها. الجدول 1: العازلة ووصفات الوسائط.

Discussion

في هذا البروتوكول ، نصف عزل المجموعات الفرعية الرئيسية الثلاث للخلايا الدبقية من الجهاز العصبي المركزي للفئران: الخلايا الدبقية الصغيرة ، OPCs ، والخلايا النجمية. تتمثل الانتكاسة الرئيسية للتحقيق في أمراض الجهاز العصبي المركزي التنكسية والالتهابات العصبية في نقص الخلايا والأنسجة البشرية الأولية ، خاصة تلك التي تكون إقليمية ومن نفس المريض. في معظم الحالات ، يتم اشتقاق خطوط خلايا الجهاز العصبي المركزي البشرية من خلايا سرطانية محولة وخالدة والتي قد لا تكون تمثيلات دقيقة لسلوكها الفسيولوجي الطبيعي²⁰،^21،22. وبالتالي ، فإن الطرق البديلة ضرورية لدراسة الأنماط الظاهرية لخلايا الجهاز العصبي المركزي بطريقة مضبوطة. علاوة على ذلك ، فإن تنوع مجموعات الخلايا الدبقية العصبية يجعل من الضروري التحقيق في كل نوع فرعي بشكل مستقل عن بعضها البعض ، وكذلك في ظروف الثقافة المشتركة من أجل تلخيص كل من وظائف خلاياها المستقلة وغير المستقلة. الخلايا الدبقية لديها مجموعة واسعة من الوظائف الحرجة في الجهاز العصبي المركزي تتراوح بين دعم الخلايا العصبية 23 ، والتعلم / الإدراك 24،^{25 ،} والاستجابات المناعية للجهاز العصبي المركزي²⁶. على هذا النحو ، من الضروري فهم الوظائف الجزيئية والخلوية لكل مجموعة فرعية دبقية في سياق فسيولوجي ومرضي. من أجل القيام بذلك ، نقدم هنا طريقة موثوقة لاستخراج وعزل الأنواع الفرعية الدبقية القابلة للحياة. نظرا للقيود العملية والأخلاقية في أبحاث الإنسان ، تعد النماذج الحيوانية حاليا أكثر البدائل صلة ببيولوجيا الخلايا الدبقية البشرية. على وجه الخصوص ، تعتبر الفئران نموذجية مثالية حيث يمكن التلاعب بالجينوم الخاص بها وتحليله لمزيد من تشريح آليات جزيئية معينة تكمن وراء الصحة والمرض. لذلك ، فإن الإزالة والفصل الناجح للخلايا الدبقية الصغيرة للفئران ، و OPCs ، والخلايا النجمية هي أداة رئيسية للتحقيق في وظائف الخلايا الدبقية أثناء الحالات الفسيولوجية أو التنكسية العصبية أو الالتهابية العصبية.

يمكن تحسين هذا البروتوكول لاستكشاف عدم التجانس الإقليمي لخلايا الجهاز العصبي المركزي. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن الدبقية تظهر عدم تجانس إقليمي في الشكل والوظيفة. الخلايا النجمية متنوعة إقليميا وتظهر مورفولوجيا متميزة اعتمادا على موقعها داخل الجهاز العصبي المركزي²⁷. علاوة على ذلك ، يمكن لكثافة الخلايا النجمية ومؤشرها الانقسامي تحديد المناطق التشريحية ، مما يدعم الفرضية القائلة بأن عدم تجانس الخلايا النجمية الإقليمية قد يعكس الاختلافات الجزيئية والوظيفية بناء على موقعها داخل الجهاز العصبي المركزي²⁸. كما أن عدم التجانس الإقليمي للخلايا الدبقية الصغيرة قيد التحقيق النشط ، على الرغم من أن الآليات الأساسية والعواقب الوظيفية لتنوع الخلايا الدبقية الصغيرة في تطور الجهاز العصبي المركزي أو سلوكه غير واضحة حاليا. ومع ذلك ، فمن المعروف أن الخلايا الدبقية الصغيرة البالغة تظهر تنوعا في عدد الخلايا والهياكل الخلوية وتحت الخلوية والتوقيعات الجزيئية²⁹. علاوة على ذلك ، فإن التطورات الحديثة في قياس الكتلة الخلوية متعددة الإرسال قد حددت بشكل أكبر عدم التجانس الإقليمي للخلايا الدبقية الصغيرة ، وتحليل النمط الظاهري الخلوي من خمس مناطق مختلفة من الجهاز العصبي المركزي لتسعة متبرعين بشريين ، مما يسمح بالتنميط المناعي على نطاق واسع للخلايا الدبقية الصغيرة^{البشرية 30}. حاليا ، هذه الأساليب في مراحلها الأولى ، مما يجعل الدراسات على الحيوانات حلا قابلا للتطبيق لدراسة الخلايا الدبقية الإقليمية في تطور مرض الجهاز العصبي المركزي. أخيرا ، تم وصف عدم التجانس الإقليمي مؤخرا في oligodendrocytes. حدد تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية على 5072 خلية فردية من 10 مناطق من الجهاز العصبي المركزي للأحداث والبالغين 13 مجموعة فرعية متميزة عبر مراحل مختلفة من التمايز³¹. الأهم من ذلك ، وجد أيضا أنه مع نضوج الخلايا قليلة التغصن من OPCs ، تباعدت ملفات تعريف النسخ الخاصة بها وتغيرت أنماطها الظاهرية الوظيفية ، مما يبرز عدم تجانس الخلايا قليلة التغصن داخل الجهاز العصبي المركزي³¹.

وبالتالي ، فإن فهم عدم التجانس الإقليمي لمختلف خلايا الجهاز العصبي المركزي المقيمة في سياق الخلايا العصبية المجاورة المتنوعة والدبقية الأخرى قد يوفر أساسا منطقيا مهما للتطوير المستقبلي لعلاجات جديدة لعلاج الاضطرابات الالتهابية العصبية والتنكسية العصبية. بينما يركز هذا البروتوكول على استخراج وعزل وتحديد المجموعات السكانية الفرعية الدبقية ، فإنه يوفر نقطة انطلاق ملائمة لفحص وظيفتها. علاوة على ذلك ، يمكن تكييفها ودمجها مع نماذج الفئران المعدلة وراثيا من أجل دراسة الآليات الجينية المرتبطة ببيولوجيا الخلية الدبقية. يمكن استخدامه أيضا لفحص استجابات الخلايا الدبقية لبعضها البعض في فحوصات الثقافة المشتركة. تمثل الخطوات الموضحة طريقة فعالة من حيث التكلفة وعالية الإنتاجية لاستخراج وعزل مجموعات دبقية الجهاز العصبي المركزي المختلفة والتي يمكن بعد ذلك تكييفها مع مجموعة واسعة من المعلمات التجريبية. وتجدر الإشارة إلى ؛ ومع ذلك ، فإن الطريقة الموصوفة هنا تستخدم حديثي الولادة بسبب انخفاض مستويات الميالين والكثافة العالية للخلايا الدبقية المتكاثرة. لهذه الأسباب ، من الممكن تقنيا عزل الدبقية القابلة للحياة عن حديثي الولادة مقارنة بالحيوانات البالغة. وبالتالي ينبغي النظر في الاختلافات المظهرية في الدبقية الوليدية مقارنة بالدبقية البالغة أثناء التصميم التجريبي وتفسير البيانات.

Materials

0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA	Gibco	25300054	Tissue dissociation
12-Well Plates	Greiner Bio-One	665 180	Cell culture plate
1X PBS pH 7.4	Gibco	10010031	Standard reagent
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative
50 mL, 25 cm2 cell culture flask	Greiner Bio-One	690 175	Cell culture (T25) flask
Antibiotic-Antimycotic 100X	Gibco	15240-096	Media component
B-27 Supplement 50X	Gibco	17504-044	Media component
Bovine serum albumin	Sigma	A9647-50G	Antibody diluent
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800	Confocal for imaging
DAPI	ThermoFisher	D1306	Nuclear stain
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate	Gibco	11995040	Media component
Dnase I	Sigma	10104159001	Tissue dissociation
Fetal bovine serum heat inactivated	Gibco	A3840001	Media component
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-1MG	Cell adherent
Fine stitch Scissors	Sklar	64-3260	Dissection tools
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Secondary staining antibody
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21434	Secondary staining antibody
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)	ThermoFisher	14170120	Tissue dissociation
L-glutamine, 200mM	Gibco	20530081	Media component
Murine epidermal growth factor	ThermoFisher	PMG8044	Media component
Murine IFN-γ	Peprotech	315-05-20UG	Media component
Murine PDGF-AA	Peprotech	315-17	Media component
Neurobasal	Gibco	21103-049	Media component
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution component
Operating Scissors	Surgi-OR	95-272	Dissection tools
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip	Corning Biocoatt	354086	Cell adherent
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technology	9071S	Mounting Media
Rabbit anti-Iba1	Wako	019-19741	Primary antibody
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan	Millipore	ab5320	Primary antibody
Rat anti-GFAP	ThermoFisher	13-0300	Primary antibody
Rat anti-myelin basic protein	Abcam	ab7349	Primary antibody
Sharp Tip Scissors	Surgi-OR	95-104	Dissection tools
Stereo Microscope	Leica	S4 E Stereo Zoom Microscope	Microscope for dissection
Tissue Forceps	Sklar	66-7644	Dissection tools
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-100	Cell permabilization
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)	Sigma	10109878001	Tissue dissociation