Her presenterer vi en protokoll for in vitro-isolering av flere gliacellepopulasjoner fra en mus CNS. Denne metoden tillater segregering av regionale mikroglia, oligodendrocyttforløperceller og astrocytter for å studere fenotypene til hver i en rekke kultursystemer.
Metodene som presenteres her viser laboratorieprosedyrer for disseksjon av fire forskjellige regioner i sentralnervesystemet (CNS) fra murine nyfødte for isolering av glial subpopulasjoner. Formålet med prosedyren er å dissosiere mikroglia, oligodendrocyttstamceller (OPCs) og astrocytter fra kortikal, cerebellar, hjernestamme og ryggmargsvev for å lette videre in vitro-analyse. CNS-regionens isolasjonsprosedyrer gjør det mulig å bestemme regional heterogenitet blant glia i flere cellekultursystemer. Rapid CNS-regionen isolasjon utføres, etterfulgt av mekanisk fjerning av hjernehinner for å hindre meningeal celle forurensning av glia. Denne protokollen kombinerer mild vevsdissosiasjon og plating på en spesifisert matrise designet for å bevare celleintegritet og overholdelse. Isolering av blandet glia fra flere CNS-regioner gir en omfattende analyse av potensielt heterogen glia samtidig som bruken av individuelle forsøksdyr maksimeres. I tillegg, etter dissosiasjon av regionalt vev, er blandet glia videre delt inn i flere celletyper, inkludert mikroglia, OPC og astrocytter for bruk i enten enkeltcelletype, cellekulturplateinnlegg eller samkultursystemer. Samlet sett gir de demonstrerte teknikkene en omfattende protokoll med bred anvendelighet for forsiktig disseksjon av fire individuelle CNS-regioner fra murine nyfødte og inkluderer metoder for isolering av tre individuelle gliacelletyper for å undersøke regional heterogenitet i et hvilket som helst antall in vitro cellekultursystemer eller analyser.
Glia er nødvendig for riktig nevronfunksjon i CNS. De består av tre store underpopulasjoner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia, hver med en annen, men uunnværlig rolle1. Uten riktig gliacellediversitet og aktivitet, ville nevronfunksjonen bli alvorlig påvirket, noe som førte til CNS-svekkelse. Glia er i stand til å påvirke nevrotransmisjon, og hver celletype gjør det på en unik måte. Gliaceller i hjernen har kapasitet til å kommunisere seg imellom, så vel som med nevronceller, for å lette riktig CNS-funksjon2. Oligodendrocytter øker hastigheten på elektrisk overføring gjennom dannelsen av en myelinskjede, noe som letter klyngen av ionkanaler ved nodene til Ranvier, stedene for nevronvirkningspotensial generasjon3. Microglia er kritisk for beskjæring av synapser ved å overvåke synaptisk overføring og “rewiring” nevronforbindelser etter skade4. I tillegg er microglia den mest tallrike bosatte immuncellen i CNS, som fungerer som den primære formen for vertsforsvar motpatogener. Astrocytter kan regulere synaptisk overføring mellom nevroner ved å modifisere konsentrasjonen av ekstracellulært kalium6. De har også roller i å kontrollere lokal blodstrøm7, frigjøre og ta opp nevromodulerende elementer8, og har en nøkkelrolle i vedlikehold av blod-hjernebarriere9. Dermed er hver glial-subtype kritisk for CNS-funksjonen, da defekter i en hvilken som helst type lenge har vært assosiert med et bredt spekter av patologiske tilstander, inkludert psykiatriske sykdommer, epilepsi og nevrodegenerative tilstander10.
Den største hindringen i studiet av CNS-patobiologi er manglende evne til å undersøke menneskelige celler i sammenheng med deres mikromiljønisje. Human biopsi vev er mest samlet post-mortem og celler kan lett bli skadet eller tapt under utvinning og behandling. Videre er det en utfordring å holde humane celler i live og levedyktige in vitro i lengre tid uten å utlede udødelige cellelinjer fra svulster, da de ikke lenger nøyaktig reflekterer deres normale fysiologiske egenskaper11,12. I tillegg er det en betydelig mengde regional heterogenitet blant individuelle gliacelletyper13,14,15, og det er nesten umulig å skaffe regionale CNS-prøver fra individuelle pasienter. Som sådan er det nødvendig å utvikle alternative modeller for å studere bidraget fra regional glia i spesifikke CNS-lidelser.
Her beskriver vi et in vitro-system ved bruk av mus CNS-regionspesifikk isolering av flere glial-subpopulasjoner, noe som muliggjør manipulering og kvantifisering av mikroglia, oligodendrocyttforløperceller (OPCs), som gir opphav til modne oligodendrocytter og astrocytter. Hver populasjon kan uavhengig isoleres og underkastes et bredt spekter av eksperimentelle teknikker, inkludert medisin- eller molekylbehandling, immunocytokjemi, protein / RNA-ekstraksjon og analyse og andre samkultursystemer avhengig av eksperimentell nødvendighet. I tillegg gir denne isolasjonsteknikken høyt cellenummer, noe som muliggjør karakterisering og undersøkelse av hver glialpopulasjon på en høy gjennomstrømningsmåte. Det gjør det også mulig å studere CNS-celledifferensiering, vekst og spredning som svar på et bredt spekter av mikromiljøstimuli på en kontrollert måte for å unngå forstyrrende faktorer som vanligvis er tilstede i en in vivo-setting. Til slutt letter denne celleisolasjonsteknikken manipulering av glialcellepopulasjoner i forskjellige CNS-regioner for å undersøke hvordan regionale glia interagerer med hverandre og reagerer på varierende stimuli, noe som muliggjør presisjon og reproduserbarhet.
I denne protokollen beskriver vi isoleringen av de tre store gliacelle-subpopulasjonene fra mus CNS: mikroglia, OPC og astrocytter. Et stort tilbakeslag for undersøkelsen av nevrodegenerative og nevroinflammatoriske CNS-sykdommer er mangelen på primære humane celler og vev, spesielt de som er regionale og fra samme pasient. I de fleste tilfeller er menneskelige CNS-cellelinjer avledet fra transformerte, udødelige kreftceller som kanskje ikke er nøyaktige representasjoner av deres normale fysiologiske oppførsel20,21,22. Dermed er alternative metoder nødvendige for å studere CNS-cellefenotyper på en kontrollert måte. Videre gjør mangfoldet av nevrologiske gliacellepopulasjoner det nødvendig å undersøke hver subtype både uavhengig av hverandre, så vel som i samkulturforhold for å rekapitulere både deres celle autonome og ikke-autonome funksjoner. Gliaceller har et bredt spekter av kritiske funksjoner i CNS som spenner fra nevronstøtte23, læring / kognisjon 24,25 og CNS immunologiske responser26. Som sådan er det nødvendig å forstå de molekylære og cellulære funksjonene til hver glial-subpopulasjon i en fysiologisk og patologisk sammenheng. For å gjøre det, gir vi her en pålitelig metode for utvinning og isolering av levedyktige glia-subtyper. På grunn av praktiske og etiske begrensninger i menneskers forskning, er dyremodeller for tiden de mest relevante surrogatene for human gliacellebiologi. Spesielt er mus ideelle modelldyr, da deres genom kan manipuleres og analyseres for ytterligere å dissekere bestemte molekylære mekanismer som ligger til grunn for helse og sykdom. Derfor er vellykket fjerning og separasjon av murine microglia, OPC og astrocytter et nøkkelverktøy for å undersøke funksjonene til glia under fysiologiske, neurodegenerative eller nevroinflammatoriske tilstander.
Denne protokollen kan optimaliseres for å utforske CNS-celle regional heterogenitet. Det blir stadig tydeligere at glia utviser regional heterogenitet i form og funksjon. Astrocytter er regionalt varierte og viser distinkt morfologi avhengig av deres plassering i CNS27. Videre kan tettheten av astrocytter og deres mitotiske indeks definere anatomiske regioner, noe som støtter hypotesen om at regional astrocytt heterogenitet kan gjenspeile molekylære og funksjonelle forskjeller basert på deres plassering innenfor CNS28. Microglial regional heterogenitet er også under aktiv undersøkelse, selv om de underliggende mekanismene og funksjonelle konsekvensene av mikrogliadiversitet i CNS-utvikling eller atferd for tiden er uklare. Det er imidlertid kjent at voksne mikroglia viser mangfold i cellenummer, celle- og subcellulære strukturer og molekylære signaturer29. Videre har nylige fremskritt innen multiplekset massecytometri ytterligere definert den regionale heterogeniteten til mikroglia, og analysert cellulær fenotype fra fem forskjellige CNS-regioner av ni humane givere, noe som muliggjør storskala immunfenotyping av humane mikroglia30. For tiden er slike tilnærminger i sine begynnende stadier, noe som gjør dyreforsøk til en levedyktig løsning for studiet av regional glia i CNS-sykdomsutvikling. Endelig har regional heterogenitet også nylig blitt beskrevet i oligodendrocytter. Enkeltcellet RNA-sekvensering på 5072 individuelle celler fra 10 regioner av juvenile og voksne CNS identifiserte 13 forskjellige underpopulasjoner på tvers av forskjellige stadier av differensiering31. Viktigere ble det også funnet at når oligodendrocytter modnet fra OPCs, divergerte deres transkripsjonsprofiler og deres funksjonelle fenotyper endret seg, og fremhevet oligodendrocyt heterogenitet i CNS31.
Dermed kan forståelse av regional heterogenitet av de forskjellige bosatte CNS-cellene i sammenheng med deres forskjellige naboneuroner og andre glia gi viktig begrunnelse for den fremtidige utviklingen av nye terapier for å behandle nevroinflammatoriske og nevrodegenerative lidelser. Mens denne protokollen fokuserer på utvinning, isolasjon og identifisering av glial-underpopulasjoner, gir den et praktisk utgangspunkt for undersøkelsen av deres funksjon. Videre kan den tilpasses og kombineres med transgene musemodeller for å studere genetiske mekanismer assosiert med gliacellebiologi. Det kan også brukes til å undersøke responsene til gliaceller til hverandre i samkulturanalyser. De skisserte trinnene representerer en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsmetode for å trekke ut og isolere forskjellige CNS-glialpopulasjoner som deretter kan tilpasses et bredt spekter av eksperimentelle parametere. Det bør bemerkes; men at metoden beskrevet her benytter nyfødte på grunn av lavere nivåer av myelinisering og høy tetthet av prolifererende glia. Av disse grunner er det teknisk mer mulig å isolere levedyktig glia fra nyfødte sammenlignet med voksne dyr. Fenotypiske forskjeller i neonatal glia sammenlignet med voksen glia bør derfor vurderes under eksperimentell design og datatolkning.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Morgan Psenicka for manuskriptredigering og diskusjon og Dr. Grahame Kidd for hjelp med figurformatering. Dette arbeidet ble støttet av NIAID K22 AI125466 (JLW).
0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA | Gibco | 25300054 | Tissue dissociation |
12-Well Plates | Greiner Bio-One | 665 180 | Cell culture plate |
1X PBS pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Standard reagent |
32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative |
50 mL, 25 cm2 cell culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | Cell culture (T25) flask |
Antibiotic-Antimycotic 100X | Gibco | 15240-096 | Media component |
B-27 Supplement 50X | Gibco | 17504-044 | Media component |
Bovine serum albumin | Sigma | A9647-50G | Antibody diluent |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 800 | Confocal for imaging |
DAPI | ThermoFisher | D1306 | Nuclear stain |
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate | Gibco | 11995040 | Media component |
Dnase I | Sigma | 10104159001 | Tissue dissociation |
Fetal bovine serum heat inactivated | Gibco | A3840001 | Media component |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141-1MG | Cell adherent |
Fine stitch Scissors | Sklar | 64-3260 | Dissection tools |
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Secondary staining antibody |
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21434 | Secondary staining antibody |
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg) | ThermoFisher | 14170120 | Tissue dissociation |
L-glutamine, 200mM | Gibco | 20530081 | Media component |
Murine epidermal growth factor | ThermoFisher | PMG8044 | Media component |
Murine IFN-γ | Peprotech | 315-05-20UG | Media component |
Murine PDGF-AA | Peprotech | 315-17 | Media component |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | Media component |
Normal goat serum | Sigma | G9023 | Blocking solution component |
Operating Scissors | Surgi-OR | 95-272 | Dissection tools |
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning Biocoatt | 354086 | Cell adherent |
Prolong Gold Antifade Reagent | Cell Signaling Technology | 9071S | Mounting Media |
Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Primary antibody |
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan | Millipore | ab5320 | Primary antibody |
Rat anti-GFAP | ThermoFisher | 13-0300 | Primary antibody |
Rat anti-myelin basic protein | Abcam | ab7349 | Primary antibody |
Sharp Tip Scissors | Surgi-OR | 95-104 | Dissection tools |
Stereo Microscope | Leica | S4 E Stereo Zoom Microscope | Microscope for dissection |
Tissue Forceps | Sklar | 66-7644 | Dissection tools |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-100 | Cell permabilization |
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white) | Sigma | 10109878001 | Tissue dissociation |