Disseksjon og isolering av Murine glia fra flere regioner i sentralnervesystemet

Summary

Her presenterer vi en protokoll for in vitro-isolering av flere gliacellepopulasjoner fra en mus CNS. Denne metoden tillater segregering av regionale mikroglia, oligodendrocyttforløperceller og astrocytter for å studere fenotypene til hver i en rekke kultursystemer.

Abstract

Metodene som presenteres her viser laboratorieprosedyrer for disseksjon av fire forskjellige regioner i sentralnervesystemet (CNS) fra murine nyfødte for isolering av glial subpopulasjoner. Formålet med prosedyren er å dissosiere mikroglia, oligodendrocyttstamceller (OPCs) og astrocytter fra kortikal, cerebellar, hjernestamme og ryggmargsvev for å lette videre in vitro-analyse. CNS-regionens isolasjonsprosedyrer gjør det mulig å bestemme regional heterogenitet blant glia i flere cellekultursystemer. Rapid CNS-regionen isolasjon utføres, etterfulgt av mekanisk fjerning av hjernehinner for å hindre meningeal celle forurensning av glia. Denne protokollen kombinerer mild vevsdissosiasjon og plating på en spesifisert matrise designet for å bevare celleintegritet og overholdelse. Isolering av blandet glia fra flere CNS-regioner gir en omfattende analyse av potensielt heterogen glia samtidig som bruken av individuelle forsøksdyr maksimeres. I tillegg, etter dissosiasjon av regionalt vev, er blandet glia videre delt inn i flere celletyper, inkludert mikroglia, OPC og astrocytter for bruk i enten enkeltcelletype, cellekulturplateinnlegg eller samkultursystemer. Samlet sett gir de demonstrerte teknikkene en omfattende protokoll med bred anvendelighet for forsiktig disseksjon av fire individuelle CNS-regioner fra murine nyfødte og inkluderer metoder for isolering av tre individuelle gliacelletyper for å undersøke regional heterogenitet i et hvilket som helst antall in vitro cellekultursystemer eller analyser.

Introduction

Glia er nødvendig for riktig nevronfunksjon i CNS. De består av tre store underpopulasjoner, astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia, hver med en annen, men uunnværlig rolle¹. Uten riktig gliacellediversitet og aktivitet, ville nevronfunksjonen bli alvorlig påvirket, noe som førte til CNS-svekkelse. Glia er i stand til å påvirke nevrotransmisjon, og hver celletype gjør det på en unik måte. Gliaceller i hjernen har kapasitet til å kommunisere seg imellom, så vel som med nevronceller, for å lette riktig CNS-funksjon². Oligodendrocytter øker hastigheten på elektrisk overføring gjennom dannelsen av en myelinskjede, noe som letter klyngen av ionkanaler ved nodene til Ranvier, stedene for nevronvirkningspotensial generasjon³. Microglia er kritisk for beskjæring av synapser ved å overvåke synaptisk overføring og “rewiring” nevronforbindelser etter skade⁴. I tillegg er microglia den mest tallrike bosatte immuncellen i CNS, som fungerer som den primære formen for vertsforsvar mot^patogener. Astrocytter kan regulere synaptisk overføring mellom nevroner ved å modifisere konsentrasjonen av ekstracellulært kalium⁶. De har også roller i å kontrollere lokal blodstrøm⁷, frigjøre og ta opp nevromodulerende elementer⁸, og har en nøkkelrolle i vedlikehold av blod-hjernebarriere⁹. Dermed er hver glial-subtype kritisk for CNS-funksjonen, da defekter i en hvilken som helst type lenge har vært assosiert med et bredt spekter av patologiske tilstander, inkludert psykiatriske sykdommer, epilepsi og nevrodegenerative tilstander¹⁰.

Den største hindringen i studiet av CNS-patobiologi er manglende evne til å undersøke menneskelige celler i sammenheng med deres mikromiljønisje. Human biopsi vev er mest samlet post-mortem og celler kan lett bli skadet eller tapt under utvinning og behandling. Videre er det en utfordring å holde humane celler i live og levedyktige in vitro i lengre tid uten å utlede udødelige cellelinjer fra svulster, da de ikke lenger nøyaktig reflekterer deres normale fysiologiske egenskaper^11,12. I tillegg er det en betydelig mengde regional heterogenitet blant individuelle gliacelletyper^13,14,15, og det er nesten umulig å skaffe regionale CNS-prøver fra individuelle pasienter. Som sådan er det nødvendig å utvikle alternative modeller for å studere bidraget fra regional glia i spesifikke CNS-lidelser.

Her beskriver vi et in vitro-system ved bruk av mus CNS-regionspesifikk isolering av flere glial-subpopulasjoner, noe som muliggjør manipulering og kvantifisering av mikroglia, oligodendrocyttforløperceller (OPCs), som gir opphav til modne oligodendrocytter og astrocytter. Hver populasjon kan uavhengig isoleres og underkastes et bredt spekter av eksperimentelle teknikker, inkludert medisin- eller molekylbehandling, immunocytokjemi, protein / RNA-ekstraksjon og analyse og andre samkultursystemer avhengig av eksperimentell nødvendighet. I tillegg gir denne isolasjonsteknikken høyt cellenummer, noe som muliggjør karakterisering og undersøkelse av hver glialpopulasjon på en høy gjennomstrømningsmåte. Det gjør det også mulig å studere CNS-celledifferensiering, vekst og spredning som svar på et bredt spekter av mikromiljøstimuli på en kontrollert måte for å unngå forstyrrende faktorer som vanligvis er tilstede i en in vivo-setting. Til slutt letter denne celleisolasjonsteknikken manipulering av glialcellepopulasjoner i forskjellige CNS-regioner for å undersøke hvordan regionale glia interagerer med hverandre og reagerer på varierende stimuli, noe som muliggjør presisjon og reproduserbarhet.

Protocol

MERK: Alle dyreforsøk ble autorisert og godkjent av Cleveland Clinic Lerner Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Forbered media og forsyninger for disseksjon MERK: Alle buffer- og medieoppskrifter er gitt i tabell 1. Denne prosedyren gjøres under sterile forhold i et vevskultur utpekt biosikkerhetsskap. Klargjør og sterilt filter blandet glia media (MGM). Dette kan gjøres dagen før og oppbevares ved 4 °C. Fortynn fibronektin ved en konsentrasjon på 1:100 med steril H2O. Volumet av fortynnet fibronektin vil avhenge av antall valper og CNS-regionen som brukes til forsøket. Bruk en T25 kolbe for 1 cortex, en T25 kolbe for 2-4 cerebella, en T25 kolbe for 2-4 hjernestammer og en T25 kolbe for 2-4 ryggmarg.MERK: Kombinere vev fra samme region ved hjelp av kriteriene ovenfor vil tillate tilstrekkelig dissosiasjon uten å endre protokollen beskrevet nedenfor. Å kombinere mer vev enn beskrevet i trinn 1.2 vil kreve ytterligere optimalisering av dissosiasjonsreagenskonsentrasjoner. Pipette 3 ml fortynnet fibronektin i T25-kolber ved romtemperatur og la den sitte i 2 minutter. Aspirer fibronektinet og la kolber tørke over natten med kolbelokket løsnet. 2. Cortex, cerebellum, hjernestamme og ryggmargsdisseksjon MERK: Denne prosedyren kan gjøres på benken og krever et disseksjonsomfang. Bruk streng aseptisk teknikk for alle trinnene i prosedyren og minimer vevseksponering for romluften. Hold alle medier nedkjølt på is under disseksjon for å sikre maksimal vevsbevaring. Alternativt kan denne prosedyren gjøres i en hette som tillater bruk av et internt disseksjonsomfang. Tørk alle områder med 70% etanol. Pipette 10 ml PBS/antibiotisk oppløsning (PAS) i en 10 cm petriskål. Forbered en petriskål for hver valp som skal dissekeres. Sett på is for å holde løsningen avkjølt. I en desinfisert vevskulturhette, pipette 9 ml DMEM (uten tilsetningsstoffer) i 4 separate 15 ml koniske rør, en for hver CNS-region, erstatt rørhetter og legg på is. Plasser isbøtte med rør innen rekkevidde fra disseksjonsomfanget. Plasser 10 cm petriskål tilberedt i trinn 2.2 på desinfisert disseksjonsomfang. Bedøv og avlive musevalp i henhold til institusjonell protokoll og fjern hodet ved rask halshugging med skarp saks.MERK: Postnatal dag (P) 3-5 valper brukes. Eldre valper har en mer utviklet CNS og er kanskje ikke en tilstrekkelig kilde til ekspanderende gliaceller. Yngre valper (P) 0-2 kan gi et høyere antall glia og kan brukes; Ryggmargsvev er imidlertid svært vanskelig å dissekere i denne unge alderen på grunn av størrelse. Rengjør valpens hud med 70% etanol. Bruk fin saks, klipp det kutane laget langs midtlinjen av dyrets hode, start kaudalt og beveg rostral, til du når snuten. Unngå å kutte dypt inn i skallen for å unngå vevskader. Vinkle hodet ned, trekk kutan lag til hver side av skallen og bruk fjærsaks, gjør et snitt langs skallen midtlinjen, starter ved foramen magnum, igjen kutter caudal til rostral. Med finspisset tang, trekk skallehalvdelene til høyre og venstre side, og utsett cortex, cerebellum og hjernestamme. Når den er eksponert, løfter du hjernen forsiktig ut av skallen og inn i den 10 cm petriskålen som tilberedes i trinn 2.2. Sørg for at hjernen forblir uskadet for å bevare anatomisk struktur, med bakhjernen festet. Bruk fine, buede tanger med punktet på tangen vendt oppover, klyp av lillehjernen. Fjern meningene og sett i angitt 15 ml konisk rør i isbøtte. Sørg for at hjernestammen er direkte ventral til lillehjernen og er synlig etter fjerning av lillehjernen. Fjern den med finspisset tang, fjern hjernehinnene og legg i angitt 15 ml konisk rør i isbøtte. Skill midthjernen fra cortex, fjern kortikale hjernehinner, og sett i utpekt 15 ml konisk rør i isbøtte. For å fjerne ryggmargen, plasser den halshuggede musevalpen i en liggende stilling (liggende med ansiktet oppover) med den avskårne ryggsøylen forhøyet mot etterforskeren. Spray igjen med 70% etanol. Klipp langs sidesidene av vertebral kolonnen, i en rostral til kaudal retning, gjennom ribbe buret til du når bakre lemmer. Mens du skjærer, skyver du tilbake de indre organene til vertebral kolonnen er synlig. Skjær langs hver sideside av virvelsøylen til den er isolert og legg den i 10 cm petriskålen tilberedt i trinn 2.2. Med ventral side opp, ved hjelp av fin fjærsaks, veksle mellom å kutte høyre og venstre side av hver ryggvirvel til du når lumbalområdet for å eksponere ryggmargsvevet. Fjern ryggmargen og meningene forsiktig med finspisset tang under dissekeringsmikroskopet. Plasser i utpekt 15 ml konisk rør i isbøtte. Gjenta trinn 2.5.-2.19 for hver valp, og kombiner vev fra samme område for å passe til kriteriene beskrevet i trinn 1.2 for hver tilberedte T25-kolbe.MERK: Fjern meningene så fullstendig som mulig. Hvis en betydelig mengde hjernehinner forblir, vil fibroblastlignende fenotype av meningealceller vokse ut og overvelde cellekulturen. Flere ryggmarger, av lik fenotype, kan kombineres for å generere en bestemt cellekultur. Pass på at overbefolkning av celler ikke forekommer, noe som kan føre til glialapoptose og differensielle fenotyper. 3. Vev dissosiasjon MERK: Alle følgende prosedyrer utføres i et sterilt vevskultur utpekt biosikkerhetsskap ved bruk av aseptisk teknikk og sterile materialer. Tilsett 1 ml 0,05% trypsin inneholdende 0,53 mM EDTA til hvert 15 ml konisk rør på 9 ml DMEM og vev for å starte vevslyse.MERK: DMEM inneholder en høy mengde kalsiumklorid, som kan fungere som en inhibitor av trypsin. Hvis dissosiasjonen ikke er fullført ved å følge de skisserte trinnene, kan Hanks balansert saltløsning uten kalsium eller magnesium brukes. Etter trypsinisering kan enzymet nøytraliseres ved å tilsette en trypsinhemmer, selv om kalsium skal tilsettes tilbake til løsningen, da det er en kofaktor for DNase I, som brukes i etterfølgende trinn. Triturat med en 10 ml pipette ca. 20x. Overfør cellesuspensjonene til tomme 50 ml koniske rør. Inkuber oppløsningen ved 37 °C, 5 % CO2 i 15 minutter, og rør lysatene forsiktig etter 8 minutter. Tilsett 5 ml MGM og 200 μL (5 mg/ml) DNase I til hvert rør for en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml. Triturat hver lysat med en 10 ml pipette 10x. La cellesuspensjonene sitte i 3 minutter ved romtemperatur for å la ikke-dissosiert vev slå seg ned i bunnen av rørene. Overfør cellesuspensjonene til nye 50 ml koniske rør, og etterlat det ikke-dissosierte vevet.MERK: Lysis- og triturasjonstrinnene beskrevet ovenfor begrenser mengden ikke-dissosiert vev betydelig. Sentrifuger rørene ved 300 x g i 3 minutter ved 4 °C uten brems. Aspirer supernatanten og resuspendere de resterende cellepellets i 5 ml MGM. Triturate pelleten med en 5 ml pipette 20x. Plate 5 ml celle suspensjoner på belagte T25 kolber. Inkuber cellene ved 37 °C, 5 % CO2 og bytt medium først etter 24 timer for å fjerne celleavfall.MERK: Noen protokoller anbefaler en innledende medieendring etter 72 timer. Optimalisering av dette trinnet kan være nødvendig. Utfør en 100% medieendring med MGM hver 48-72 timer til cellene er 80% sammenflytende (ca. 5-7 dager).MERK: Alle medier må varmes opp til 37 °C før medieskift. 4. Microglia-isolasjon Når blandede gliakulturer har nådd 80% sammenløp, klargjør kolber for risting ved å stramme lokkene og forsegle med parafinfilm. For å fjerne mikroglia fra blandede glialkulturer, fest kolber horisontalt på en orbital shaker inne i en 37 ° C inkubator. Rist kolber ved 15 x g i 1 time. Fjern media og pipette i et 15 ml konisk rør. Skyll kolber to ganger med 3 ml varm MGM, og tilsett vask til de 15 ml koniske rørene. Dette er microglia. Tilsett 5 ml varm, frisk MGM til kulturflaskene. Reseal flasker med parafinfilm, fest kolber horisontalt på shaker, og rist ved 15 x g ved 37 ° C i 15 timer for separasjon av OPC fra astrocytter.MERK: Dette trinnet kan gjøres over natten, men 15 timers ristetid er kritisk, da overflødig tid kan føre til celledød. Sentrifuge supernatanten fra trinn 4.3. ved 300 x g i 3 minutter og dyrk mikroglia i henhold til standardprotokoller16 eller bruk for en biologisk analyse. 5. Oligodendrocytt forløper celle isolasjon MERK: Ved plettering av OPC-er etter innledende isolasjon, må de belegges på en poly-D-lysinbelagt overflate (steril plate eller dekselslip). Forbered disse materialene før ferdigstillelse av denne delen. Etter 15 timers risting, fjern supernatanten fra kolber og tallerken på steril 100 mm petriskål. Inkuber supernatanten ved 37 °C, 5% CO2 i 30 min, virvle etter 15 minutter for å fjerne gjenværende mikroglia, da disse veldig raskt vil feste seg til parabolen. Ikke-vevskulturbehandlede petriskåler kan brukes til dette trinnet. Fjern ikke-adherent celle supernatant, telle og plate på en poly-D-lysinbelagt overflate. Vanligvis er 7,500-10,000 OPC belagt / cm2. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i minst 1 time (opptil 6 timer), aspirer deretter forsiktig 95 % av mediet, og tilsett sakte varme OPC Media, pipetteringsmedier mot veggen i brønnen for å minimere forstyrrelser av OPC-er. Bytt medium hver 48. time til cellene er klare til bruk.MERK: Det er viktig at bare en brønn endres om gangen. OPC er følsomme og er spesielt intolerante mot tørre forhold. Tillegg av PDGF-AA i OPC-medier er å forsinke OPC-modning til oligodendrocytter. Denne faktoren kan utelukkes fra kulturmedier hvis eksperimentelt fokus er modne oligodendrocytter. 6. Astrocytt isolasjon Etter 15 timers risting, fjern supernatant og skyll kolber 2x med varm 1x PBS. Tilsett 4 ml 0,05 % trypsin inneholdende 0,53 mM EDTA og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 5 minutter eller til cellene har løftet seg. For å sikre at astrocytter har løftet, visualiser dem ved hjelp av et standard bredfeltsmikroskop. Astrocytter vil virke sfæriske etter trypsinisering. Når astrocytter har løsnet, stå kolbe vertikalt og tilsett 4 ml MGM. Triturat å blande. Pipette astrocytter i et 15 ml konisk rør, sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter. Resuspendere astrocytter i Astrocyte Media og plate på fibronektinbelagt overflate som beskrevet i trinn 1.2. eller bruk for biologisk analyse.MERK: 20 ng / ml murine fibroblast vekstfaktor kan legges til under den første medieendringen for å bidra til å etablere astrocytkulturen. I tillegg kan standard gelatinbelegg være et billig alternativ til fibronektin. 7. Identifisering og isolering av mikroglia, OPCs, astrocytter og modne oligodendrocytter ved bruk av immunocytokjemi Når belagte celler har nådd passende sammenløp, fjern forsiktig media og fest klebende celler ved å bruke 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 minutter. Gjør dette trinnet i et biosikkerhetsskap.MERK: Når du aspirerer eller tilsetter oppløsninger, pipetter med forsiktig trykk for å forhindre celleløsning. Aspirer PFA sakte og vask deretter celler 3x med 1x PBS i 5 minutter. Klargjør passende blokkeringsløsning ved bruk av 10% serum og 0,1% Triton X-100 i 1x PBS.MERK: Serumkilden gjenspeiler vertsdyret der det sekundære antistoffet ble hevet. For eksempel, hvis det sekundære antistoffet er geitantikanin, er det passende blokkerende serumet normalt geitserum. På samme måte, hvis det sekundære antistoffet er esel-antikanin, bør det blokkerende serumet være normalt eselserum. Legg til blokkeringsløsning til cellene er helt dekket. Blokker i 1 time ved romtemperatur. Klargjør en antistofffortynningsløsning (9 ml 1x PBS, 0,01 g bovint serumalbumin, 30 μL Triton X-100). Alternativt kan antistoffer fortynnes i blokkeringsoppløsningen beskrevet i trinn 6.3. Fortynn primære antistoffer som er spesifikke for følgende i antistofffortynningsmiddel eller blokkerende oppløsning:Microglia: ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1 (Iba1) ved en fortynning på 1:250 (2,4 μg/ml). OPCs: nevral/glial antigen 2 (NG2) ved en 1:200 fortynning (5 μg/ml). Modne oligodendrocytter: myelin basisk protein (MBP) ved en 1:400 fortynning (konsentrasjonen er mye avhengig og optimalisering kan være nødvendig). Astrocytter: glial fibrillært surt protein (GFAP) ved 1:400 fortynning (0,25 μg / ml) 17.MERK: Ikke bland primære antistoffer oppdratt i samme art.MERK: GFAP vil på en pålitelig måte merke astrocytter i hvit substans. For astrocytter i grå substans kan det være nødvendig å bruke en alternativ markør. Inkuber primært antistoff over natten ved 4 °C (med lett agitasjon er å foretrekke). Vask 3x med 1x PBS i 5 minutter for å fjerne det primære antistoffet. Inkuber celler med passende sekundære antistoffer ved en 1:400 fortynning i antistofffortynningsmiddel eller blokkerende oppløsning beskyttet mot lys.MERK: Sekundære antistoffer konjugeres til en fluorofor som kan byttes ut avhengig av tilgjengelige mikroskopparametere. Når fluorescerende sekundære antistoffer er påført, beskytt mot lys så mye som mulig. Inkuber sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur, noe som begrenser eksponering for lys. Vask 3 ganger med 1x PBS i 5 minutter for å fjerne overflødig sekundært antistoff. For å merke kjerner, bruk en 1: 1,000 DAPI / PBS-løsning og inkuber celler i 5 minutter ved romtemperatur i mørket. Vask 3x med 1x PBS i 5 min i mørket. For å montere, bruk monteringsmedier og la det tørke i mørket før avbildning.MERK: Monterte lysbilder kan oppbevares ved romtemperatur i 2-3 dager. For langtidsoppbevaring, flytt lysbildene til 4 °C. Bilde innen en uke for maksimalt signal. Alle representative bilder er avbildet på et konfokalt mikroskop; Imidlertid anbefales også inverterte fluorescerende mikroskoper.

Representative Results

Representative data vist nedenfor illustrerer at IFNγ-signalering påvirker OPC-differensiering og modning. Uten tilstedeværelse av IFNγ-reseptor (IFNγR) differensierer ikke kortikale OPC like lett til modne myeliniserende oligodendrocytter, noe som fremgår av fravær av MBP-farging (figur 1). Siden oligodendrocytter og astrocytter er avledet fra en vanlig stamfar, analyserte vi GFAP-uttrykk, som merker astrocytter. Vi fant at IFNγR-mangelfulle celler sterkt uttrykker GFAP, noe som tyder på at de kan vedta en astrocytisk fenotype, noe som bekrefter tidligere rapporter19. Ytterligere bevis for regional heterogenitet i CNS-celler er påvist ved varierende astrocyttmorfologi sett i astrocytter fra cortex, cerebellum, hjernestamme og ryggmarg (figur 2). Merk at astrocytter fra samme region også kan utvise morfologisk heterogenitet, noe som støtter forestillingen om at denne glial-subtypen er svært dynamisk. Forskjellene i cellulær arkitektur tyder på funksjonelt mangfold, og dermed er evnen til å isolere glialpopulasjoner nødvendig for å studere fenotypiske responser i fravær og tilstedeværelse av mikromiljøstimuli. Oligodendrocytter er kritiske for myelinisering av nevronale aksoner og er nødvendige for riktig CNS-reparasjon og funksjon. OPC gir opphav til sine modne kolleger, noe som gjør det kritisk å forstå biologien bak deres evne til å differensiere. Cytokinsignalering påvirker stamcelle- og immuncelleadferd betydelig. Det er derfor viktig å forstå hvordan regionale responser av OPC kan variere fra differensiell cytokinstimulering (figur 3), noe som kan påvirke deres evne til å differensiere til modne myeliniserende oligodendrocytter. Figur 1: Representative data som viser OPC-differensiering i WT- og IFNγR-/- mus i nærvær av eksogene IFNγ. Kortikal OPC ble isolert fra ( A ) WT og (B) IFNγR-/- P4 musevalper etter prosedyren beskrevet ovenfor. Cellene ble behandlet med 1 ng/ml IFNγ i 48 timer, deretter festet og farget for å avgrense celledifferensiering. OPC ble merket for NG2 og GFAP for å identifisere de som vedtok en astrocytisk fenotype. På samme måte ble OPC også merket for NG2 og MBP for å identifisere de som differensierte i modne oligodendrocytter. Skala bar = 20 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Representative data som viser regional heterogenitet i astrocyttmorfologi. Astrocytter fra cortex, cerebellum, hjernestamme og ryggmarg ble isolert fra P4 musevalper ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor og merket for GFAP (grønn) ved immuncytokjemi etter 48 timer i kultur. Skala bar = 20 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Representative data som viser differensiell respons av regionale OPCer på cytokiner. OPC ble isolert fra hjernestammen og ryggmargen til P4 musevalper ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner (1-10 ng/ml) av (A) IFNγ eller (B) interleukin (IL)-17 for å undersøke cytokinets differensielle påvirkning på regionale OPCs evne til å differensiere til myeliniserende oligodendrocytter. Etter en 48 timers inkubasjon med spesifiserte cytokiner ble OPC fikset og merket for NG2 (grønn) og MBP (rød). Skala bar = 20 μM. Data representerer betyr ± SEM. **, s < 0,01; , s < 0,001; , p < 0,0001 med 2-veis ANOVA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. PBS/Antibiotisk løsning (PAS): 1,0 ml 100X Antibiotika / Antimykotisk inneholdende 10.000 enheter / ml penicillin og 10.000 mg / ml streptomycin 25 mg/ml Amfotericin B 99 ml 1X PBS Blandet Glia Media (MGM) 88 ml 1X DMEM (høy glukose, m/L-glutamin, m/Na pyruvat) 10 ml Varme-inaktivert FBS 1,0 ml L-glutamin (100X) 1,0 ml Antibiotikum/Antimykotisk OPC-medier (50 ml) 49 ml Neurobasale medier 1,0 ml B27 tillegg (50X) 10 ng/ml PDGF-AA MERK: PDGF-AA tilsettes fersk før hver medieendring. Astrocytt Media (1 L) 764 ml MEM med Earles salter som inneholder glutamin 36 ml Glukose (bruk 100 mg/ml stamløsning for endelig konsentrasjon på 20 mM) 100 ml Varme-inaktivert FBS 100 ml Varmeinaktivert hesteserum 10 ml Glutamin (bruk 200 mM lager hvis det ikke er inkludert i lagermedium) VALGFRITT: 10 ng/ml rekombinant epidermal vekstfaktor for mus MERK: Sterilt filtrer alle medier og oppbevar ved 4 °C til det er brukt. Tabell 1: Buffer- og medieoppskrifter.

Discussion

I denne protokollen beskriver vi isoleringen av de tre store gliacelle-subpopulasjonene fra mus CNS: mikroglia, OPC og astrocytter. Et stort tilbakeslag for undersøkelsen av nevrodegenerative og nevroinflammatoriske CNS-sykdommer er mangelen på primære humane celler og vev, spesielt de som er regionale og fra samme pasient. I de fleste tilfeller er menneskelige CNS-cellelinjer avledet fra transformerte, udødelige kreftceller som kanskje ikke er nøyaktige representasjoner av deres normale fysiologiske oppførsel^20,21,22. Dermed er alternative metoder nødvendige for å studere CNS-cellefenotyper på en kontrollert måte. Videre gjør mangfoldet av nevrologiske gliacellepopulasjoner det nødvendig å undersøke hver subtype både uavhengig av hverandre, så vel som i samkulturforhold for å rekapitulere både deres celle autonome og ikke-autonome funksjoner. Gliaceller har et bredt spekter av kritiske funksjoner i CNS som spenner fra nevronstøtte²³, læring / kognisjon ^24,25 og CNS immunologiske responser²⁶. Som sådan er det nødvendig å forstå de molekylære og cellulære funksjonene til hver glial-subpopulasjon i en fysiologisk og patologisk sammenheng. For å gjøre det, gir vi her en pålitelig metode for utvinning og isolering av levedyktige glia-subtyper. På grunn av praktiske og etiske begrensninger i menneskers forskning, er dyremodeller for tiden de mest relevante surrogatene for human gliacellebiologi. Spesielt er mus ideelle modelldyr, da deres genom kan manipuleres og analyseres for ytterligere å dissekere bestemte molekylære mekanismer som ligger til grunn for helse og sykdom. Derfor er vellykket fjerning og separasjon av murine microglia, OPC og astrocytter et nøkkelverktøy for å undersøke funksjonene til glia under fysiologiske, neurodegenerative eller nevroinflammatoriske tilstander.

Denne protokollen kan optimaliseres for å utforske CNS-celle regional heterogenitet. Det blir stadig tydeligere at glia utviser regional heterogenitet i form og funksjon. Astrocytter er regionalt varierte og viser distinkt morfologi avhengig av deres plassering i CNS²⁷. Videre kan tettheten av astrocytter og deres mitotiske indeks definere anatomiske regioner, noe som støtter hypotesen om at regional astrocytt heterogenitet kan gjenspeile molekylære og funksjonelle forskjeller basert på deres plassering innenfor CNS²⁸. Microglial regional heterogenitet er også under aktiv undersøkelse, selv om de underliggende mekanismene og funksjonelle konsekvensene av mikrogliadiversitet i CNS-utvikling eller atferd for tiden er uklare. Det er imidlertid kjent at voksne mikroglia viser mangfold i cellenummer, celle- og subcellulære strukturer og molekylære signaturer²⁹. Videre har nylige fremskritt innen multiplekset massecytometri ytterligere definert den regionale heterogeniteten til mikroglia, og analysert cellulær fenotype fra fem forskjellige CNS-regioner av ni humane givere, noe som muliggjør storskala immunfenotyping av humane mikroglia³⁰. For tiden er slike tilnærminger i sine begynnende stadier, noe som gjør dyreforsøk til en levedyktig løsning for studiet av regional glia i CNS-sykdomsutvikling. Endelig har regional heterogenitet også nylig blitt beskrevet i oligodendrocytter. Enkeltcellet RNA-sekvensering på 5072 individuelle celler fra 10 regioner av juvenile og voksne CNS identifiserte 13 forskjellige underpopulasjoner på tvers av forskjellige stadier av differensiering³¹. Viktigere ble det også funnet at når oligodendrocytter modnet fra OPCs, divergerte deres transkripsjonsprofiler og deres funksjonelle fenotyper endret seg, og fremhevet oligodendrocyt heterogenitet i CNS³¹.

Dermed kan forståelse av regional heterogenitet av de forskjellige bosatte CNS-cellene i sammenheng med deres forskjellige naboneuroner og andre glia gi viktig begrunnelse for den fremtidige utviklingen av nye terapier for å behandle nevroinflammatoriske og nevrodegenerative lidelser. Mens denne protokollen fokuserer på utvinning, isolasjon og identifisering av glial-underpopulasjoner, gir den et praktisk utgangspunkt for undersøkelsen av deres funksjon. Videre kan den tilpasses og kombineres med transgene musemodeller for å studere genetiske mekanismer assosiert med gliacellebiologi. Det kan også brukes til å undersøke responsene til gliaceller til hverandre i samkulturanalyser. De skisserte trinnene representerer en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsmetode for å trekke ut og isolere forskjellige CNS-glialpopulasjoner som deretter kan tilpasses et bredt spekter av eksperimentelle parametere. Det bør bemerkes; men at metoden beskrevet her benytter nyfødte på grunn av lavere nivåer av myelinisering og høy tetthet av prolifererende glia. Av disse grunner er det teknisk mer mulig å isolere levedyktig glia fra nyfødte sammenlignet med voksne dyr. Fenotypiske forskjeller i neonatal glia sammenlignet med voksen glia bør derfor vurderes under eksperimentell design og datatolkning.

Materials

0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA	Gibco	25300054	Tissue dissociation
12-Well Plates	Greiner Bio-One	665 180	Cell culture plate
1X PBS pH 7.4	Gibco	10010031	Standard reagent
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Fixative
50 mL, 25 cm2 cell culture flask	Greiner Bio-One	690 175	Cell culture (T25) flask
Antibiotic-Antimycotic 100X	Gibco	15240-096	Media component
B-27 Supplement 50X	Gibco	17504-044	Media component
Bovine serum albumin	Sigma	A9647-50G	Antibody diluent
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 800	Confocal for imaging
DAPI	ThermoFisher	D1306	Nuclear stain
DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate	Gibco	11995040	Media component
Dnase I	Sigma	10104159001	Tissue dissociation
Fetal bovine serum heat inactivated	Gibco	A3840001	Media component
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141-1MG	Cell adherent
Fine stitch Scissors	Sklar	64-3260	Dissection tools
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Secondary staining antibody
Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A21434	Secondary staining antibody
Hanks' Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)	ThermoFisher	14170120	Tissue dissociation
L-glutamine, 200mM	Gibco	20530081	Media component
Murine epidermal growth factor	ThermoFisher	PMG8044	Media component
Murine IFN-γ	Peprotech	315-05-20UG	Media component
Murine PDGF-AA	Peprotech	315-17	Media component
Neurobasal	Gibco	21103-049	Media component
Normal goat serum	Sigma	G9023	Blocking solution component
Operating Scissors	Surgi-OR	95-272	Dissection tools
Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip	Corning Biocoatt	354086	Cell adherent
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technology	9071S	Mounting Media
Rabbit anti-Iba1	Wako	019-19741	Primary antibody
Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan	Millipore	ab5320	Primary antibody
Rat anti-GFAP	ThermoFisher	13-0300	Primary antibody
Rat anti-myelin basic protein	Abcam	ab7349	Primary antibody
Sharp Tip Scissors	Surgi-OR	95-104	Dissection tools
Stereo Microscope	Leica	S4 E Stereo Zoom Microscope	Microscope for dissection
Tissue Forceps	Sklar	66-7644	Dissection tools
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-100	Cell permabilization
Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)	Sigma	10109878001	Tissue dissociation