Summary
본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.
Abstract
타고난 면역 계통은 방류염, 당뇨병 망막병증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 안구 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 선천성 면역 세포, 특히 단핵 phagocytes는, 이 인구를 확인하는 도전을 만드는 중첩된 세포 표면 마커를 표현합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정은 마우스 눈에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포를 분화하기 위해 다중 세포 표면 마커의 동시적 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 전체 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화 및 골수성 세포 마커에 대한 단일 세포 현탁액의 염색을 설명합니다. 또한 단일 색상 컨트롤을 사용하여 전압을 결정하고 형광을 사용하여 양성 게이트를 구분하는 데 적합한 방법을 설명합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 한계는 조직 아키텍처의 부재이다. 이러한 제한은 개별 안구 구획의 다중 파라미터 흐름 세포측정또는 무료 면역형광 염색에 의해 극복될 수 있다. 그러나 면역 형광은 대부분의 현미경에 정량적 분석의 부족과 형광수 감소에 의해 제한됩니다. 우리는 레이저 유도 된 천체 신생 혈관화에서 단핵 phagocytes의 고도로 정량적 분석을 제공하기 위해 다중 파라메트릭 흐름 세포측정제의 사용을 설명합니다. 또한, 다중 파라미터 흐름 세포측정은 전사 또는 프로테오믹 연구를 위한 대식세포 서브세트, 운명 매핑 및 세포 분류의 식별에 사용될 수 있다.
Introduction
타고난 면역 계통은 보충 활성화 및 염증을 자극하는 다중 세포 모형을 포함합니다. 타고난 면역 세포는 자연 살인자 (NK) 세포, 비만 세포, basophils, 호산구, 호중구 및 단핵 phagocytes를 포함합니다. 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포로 구성된 단핵 phagocytes는, 포도막염, 당뇨병 망막증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 다중 안과 조건의 병리생리학에 연루되었습니다 (AMD)1. 이 프로토콜에서는, 우리는 neovascular AMD2의마우스 모형에 있는 다중 파라미터 유량 세포측정 분석을 사용하여 단핵 phagocytes의 식별에 집중할 것입니다. 이 프로토콜은 당뇨병 망막증 및/또는 방류염의 마우스 모델에 적응할 수 있지만 이러한 질병의 전신 특성 때문에 더 광범위한 안구 해부를 권장합니다.
단일 핵 세포는 중첩 세포 표면 마커를 표현합니다. 오래 지속되는 조직 상주 대식세포 및 마이크로글리아는 노른자 낭 유래 에리스로마일로이드 전구체3로부터유래하며, 대식세포및 수지상세포를 재활용하면서 골수 유래 대식세포 수지상 세포 전구4와분화한다. 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포에 공통적인 마우스 세포 표면 마커는 CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17및 세포내 마커 Iba18을포함한다. 이러한 과제를 극복하기 위해 다중 조직에서 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포의 전사 분석은 CD64를 대식세포 별 세포 표면 마커6으로정의한다. 대식세포는 아이리스, 코로이드, 주모체 및 시신경에서 건강한 눈3에서기술되었다. 대안적으로, 수지상 세포 식별은 더 어렵습니다; 수지상 세포 식별의 가장 구체적인 방법은 Zbtb46-GFP 리포터 마우스9를사용하여 운명 매핑이 필요합니다. 이러한 리포터 라인과 무관한 CD64의 부재와 함께 CD11c 및 MHCII의 발현은 잠재적 수지상 세포6,10을식별할 수 있다. 수지상 세포는 정상눈(11)에서각막, 결막, 홍채 및 코로이드에서 확인되었습니다. Microglia는 망막에 위치한 전문 대식세포이며, 혈액 망막 장벽에 의해 보호되고, 노른자 낭 전구세포(12)로부터유래된다. 그 결과, 망막 마이크로글리아는 CD45발현(13)과 높은 수준의 Tmem119의 희미한 수준에 의해 단세포 유래 대식세포로부터 분화될 수 있으며, 이는 유동 세포측정항체(14)로이용된다. microglia 활성화시, 그러나, CD45는15및 Tmem119가 마이크로글리아 생물학의 복잡성을 보여주는 다운 규제3일수 있고 이것은 AMD와 그것의 마우스 모형 둘 다에서 관련될 가능성이 높습니다. 마지막으로, 단핵구는 고전과 비고전을 포함하여 적어도 두 개의 특수형으로 나눌 수 있습니다. 클래식 단핵구디스플레이 CCR2+Ly6C높은CX3CR1낮은 발현, 비클래식 단핵구는 CCR2-Ly6C로우CX3CR1하이 마커5를보여줍니다.
마커 발현의 정량적 분석의 필요성으로 인해, 즉, 낮은/딤 수준대 높은, 다중 파라미터 흐름 세포분석은 눈 및 기타 조직에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포 간의 차별을 위한 이상적인 방법입니다. 추가적인 이점은 하위 집단의 식별, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전사 또는 프로테오믹 분석을 위한 세포 집단을 분류하는 기능, 운명 매핑을 포함한다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 단점은 조직 아키텍처의 부족이다. 각막, 결막, 홍채, 렌즈, 망막 및 choroid-sclera 복합체 : 이것은 다양한 안구 하위 구획으로 안과 해부에 의해 극복 될 수있다. 추가적으로, 확인 면역 형광 화상 진찰은 수행될 수 있습니다, 그러나 마커의 수 및 강력한 수량의 부족에 의해 제한됩니다.
게놈 넓은 협회 연구는 AMD16과다중 보완 유전자를 연결했다. 보완 활성화는 아나필라톡신 생산, 백혈구 모집 및 결과 염증으로 이어집니다. 보완 수용체 결핍 마우스에서 레이저 부상은 단핵 phagocyte 모집 및 레이저 유도 된 천골 신혈관화 (CNV)영역(17)을감소시킨다. 유사하게, C-C 모티프 케모키네 수용체 2(CCR2) 녹아웃 마우스는 조직에 대한 단세포 모집에 결핍되어, 단일핵 세포모집및 레이저 유도 CNV영역(18)을모두 감소시키는 것을 보여준다. 이러한 데이터 링크는 실험적인 CNV 및 아마도 신생 혈관 AMD와 상호 핵 phagocytes를 보완합니다. 이 협회의 지원에서, 보충 수용체는 신생아 AMD19,20을가진 환자에 있는 말초 혈액 단핵구에 소화된다. 이 데이터는 AMD와 단핵 phagocytes 사이 강한 협회를 보여줍니다.
본 원고에서는, 다중 파라미터 유동 세포측정을 이용하여 마우스 눈내의 단일핵 식세포 집단을 특성화하기 위해 실험레이저 유도 CNV 모델을 사용할 것이다. 레이저 유도 CNV는 현재 제1회 선 neovascular AMD치료(21)의효능을 입증한 중혈관 AMD의 표준 마우스 모델이다. 이 프로토콜은 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화, 항체 염색, 단일 색상 제어를 사용하여 레이저 전압의 결정 및 형광을 뺀 하나(FMO) 컨트롤을 사용하여 게이팅 전략을 설명합니다. 레이저 유도 CNV 모델에 대한 자세한 설명은 이전간행물(22)을참조하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 마이크로글리아, 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포 집단을 정의합니다. 또한, 우리는 MHCII와 CD11c를 사용하여 레이저 유도 된 CNV 모델 내에서 대식세포 하위 집합을 더욱 정의할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 절차는 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. C57BL/6 마우스는 노스웨스턴 대학(시카고, 일리노이)의 비교 의학 센터의 장벽 시설에 수용되었습니다. 모든 동물은 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12/12 h 빛 / 어두운 주기에 보관되었다.
1. 안구 조직 의 수집
- 마우스가 반응하지 않고 더 이상 흡입할 때까지 이산화탄소의 규제 투여를 사용하여 성관계를 10-12주 된 C57BL/6J 마우스를 희생하십시오. 자궁 경부 탈구 또는 안락사를 보장하기 위해 다른 승인 된 보조 방법을 수행합니다.
참고: 경외 관류는 안구 조직에 없는 순환 백혈구를 제거하기 위해 수행될 수 있다. 이 실험에서 전신 관류는 치료되지 않거나 레이저로 처리된 전체 눈에서 검출된 마이크로글리아, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 수를 감소시키지 않습니다. 따라서, 이러한 세포 유형의 대부분은 안과 조직에 위치하고 이 단계는 선택 사항입니다. - 눈을 방출하려면 소켓에서 눈에 띄는 곡선 집게 한 켤레를 눈 아래에 부드럽게 놓으면서 눈 소켓 근처에서 아래로 밀어 넣습니다. 실제 눈을 압박하지 않고 눈 밑에 닫혀 있는 집게를 꼬집습니다. 주변 결막에서 눈을 떼어 (사전 간행물을 참조하십시오)23.
- 시신경이 눈을 분리하는 유일한 남은 연결이 될 때까지 측면으로 눈을 당깁니다. 시신경은 종종 긴장으로 절단하지만, 작은 가위는 때때로 시신경을 잘라 해야합니다. 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브에 칼슘과 마그네슘을 곁들인 차가운 1x 행크의 완충식식용액(HBSS)에 눈을 놓습니다.
2. 안구 조직의 소화
- 감기 HBSS에서 0.1 mg/mL 소화 효소및 0.2 mg/mL DNase를 함유한 소화 버퍼를 준비합니다. 분해 5 mg 소화 효소에 2 mL 멸균 수 처음에. HBSS에서 10 mg/mL DNase의 초기 희석을 준비하십시오. 소화 완충제의 10mL마다(3마리에 충분)는 0.4mL의 분해된 소화 효소와 희석DNase I의 0.2mL로 감기 HBSS의 9.4mL를 혼합한다.
참고: 이러한 농도는 세포 사멸을 감소시키면서 단일 세포의 항체 염색의 최적 수준을 제공하기 위해 여러 실험을 통해 경험적으로 결정되었다. 콜라게나아제 D는 세포 생존가능성이 감소하고 CD45+ 세포를 감소시키기 위한 소화 효소의 대안으로 시험하였다. 소화를 최적화하기 위한 반복 과정에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오. - 10배 의 총 배율에서 해부 현미경으로, 감기 HBSS에서 미세 집게와 스프링 가위를 사용하여 나머지 결막 및 시신경을 제거하십시오.
- 깨끗한 눈을 마른 해부 접시 또는 작은 계량 보트로 이동합니다. 2개의 천공 상처가 시각적 축을 통해 눈에 만들어지고 소화 완충제 퇴신을 위한 이 첫 번째 상처에서 90° 떨어진 후에 유리체 구멍에 30G 바늘을 장착한 주사기를 통해 소화 버퍼의 0.15-0.20 mL/눈을 주입하십시오.
- 0.5mm x 0.5mm보다 작은 모든 조각으로 스프링 가위와 미세 한 집게를 사용하여 전체 눈을 다진. 후속 단계에서 파이펫 팁을 막히는 것을 방지하기 위해 집게를 통해 무딘 기계적 중단렌즈 조직을 분리합니다. 각 샘플에 대해 0.75mL의 소화 버퍼로 각각 집게와 가위를 작은 접시에 헹구습니다. 각 샘플에 새 접시를 사용하십시오.
- 접시의 내용을 P1000 파이펫을 사용하여 얼음에 해리 튜브로 전달하여 파이펫 이송에 있는 물질을 잃지 않도록 주의하십시오. 소화 버퍼의 추가 1.5 mL로 접시를 헹구면 용해 관의 총 부피를 3.25-3.50 mL로 가져 오는 다.
- 전동식 프로그램인 실온에서 200rpm에서 1분 단방향 회전으로 구성된 전자 해리튜브와 달리기 사이클 "m_brain_03_01"에 반역된 소양 튜브를 배치합니다. 모든 조직이 소화 완충제및 이 및 남은 모든 단계에 대한 로터와 접촉하여 해리 튜브의 맨 아래에 있는지 확인하십시오.
- 37°C에서 200rpm에서 30분 동안 흔들리는 인큐베이터에 해리 튜브를 놓습니다.
- 추가 시간 2.6 및 2.7 단계를 반복합니다. 다음 30 분 인큐베이션은 2.6 단계에서와 같이 전자 해리를 사용하여 하나의 최종 기계적 소화를 수행합니다.
- 10mL의 냉류 버퍼를 추가하여 반응을 멈추고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
3. 세포 현탁액 준비
- 단세포 서스펜션을 만들려면 50mL 원심분리기 튜브 상단에 놓인 40 μm 필터를 통해 중단된 눈 소화 반응을 부수십시오. 2.5mL 주사기의 플런저를 사용하여, 필터를 통해 소화되지 않은 눈 조직의 나머지 조각을 밀어 넣습니다.
- 동일한 플런저를 사용하기 전에 10mL의 플로우 버퍼로 해리 튜브를 씻고 필터를 헹구고 소화되지 않은 눈 조직 조각을 필터를 통해 다시 전달합니다.
- 5mL의 플로우 버퍼를 사용하여 3.2 단계를 반복합니다.
- 마지막 10mL의 플로우 버퍼로 해리 튜브와 필터를 세척합니다.
참고: 소화 및 유량 버퍼의 총 부피는 각 샘플에 대해 약 38-40mL입니다. - 원심 분리는 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 튜브를 분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 decant.
- 멸균 물에 10배 용액을 추가하여 1배 용액을 준비합니다. 다른 튜브에 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 분해합니다. 적혈구를 lyse하려면 실온 (RT)에서 소용돌이치는 30 s용 1 x 용액 1 mL을 추가하십시오.
- 플로우 버퍼20mL로 반응을 중지합니다.
- 원심 분리는 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 튜브를 분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 decant.
- 다른 튜브에 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 분리합니다. 튜브 당 차가운 1x HBSS 5mL를 추가합니다.
- 4°C에서 10분 동안 400 x g의 원심분리기 튜브. 흡인 슈퍼 네티볼.
4. 단핵 교핵 세포에 대한 세포 현탁액의 염색
- 차가운 HBSS에서 라이브/데드 염료 1:5,000를 희석하여 샘플당 0.5mL의 라이브/데드 얼룩을 준비하십시오.
- P1000 파이펫을 사용하여 각 샘플에 라이브/데드 얼룩을 추가하여 펠릿을 완전히 분리합니다. 샘플을 1.2mL 마이크로 티터 튜브로 이송합니다.
- 작은 알리쿼트(10μL)를 사용하여 혈류계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다(참조 4.4 참조). 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 라이브 / 데드 얼룩으로 샘플을 인큐베이션하십시오.
- Trypan blue를 사용하여 셀을 계산하여 샘플당 라이브 셀 수를 결정합니다.
참고: 일반적으로 10-12주 된 C57BL/6J 마우스의 눈 2개가 2 x 106 살아있는 세포를 함유하고 있습니다. - 차가운 흐름 버퍼400 μL을 추가하여 샘플을 세척하십시오. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.
- 콜드 플로우 버퍼의 500 μL에서 셀을 완전히 다시 중단합니다. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.
- Fc 블록의 50 μL에서 최대 5 x 106 살아있는 세포를 차단하십시오 (정제 된 쥐 의 차가운 흐름 버퍼에서 1:50 희석). 5 x 106 이상의 살아있는 세포가 면, 적절하게 볼륨을 증가시면.
- 펠릿에 FC 블록을 추가하여 샘플을 완전히 분리합니다. 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 5 x 106 살아있는 세포당 항체 염색 용액50 μL(용액에 포함된 각 항체의 선택 및 양을 위한 표 1 참조)을 Fc 블록의 세포에 직접 넣고 완전히 섞는다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 항체 수량은 유동 세포계 구성에 따라 달라지며 모든 실험실 및 기기에 대해 독립적으로 적정화되어야 합니다. 필터와 미러의 계측기 구성은 표 2를 참조하십시오. 항체를 적재하려면 제조업체의 권장 사항으로 시작하여 염색 지수를 계산합니다. 다양한 항체 농도(제조업체의 권장 량 상하)의 테스트 실행을 수행하고 염색 지수가 유지되는 항체의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 또한 단일 색상 컨트롤보다 덜 밝은 포지티브 염색을 보장합니다. 얼룩이 없는 세포를 사용하여 음수 염색된 세포가 규모에 있고 1 x 102미만의 피크가 있는지 확인하십시오. 형광을 사용하여 하나의 대조군을 사용하여 양색 된 세포를 정의하십시오. - 냉류 버퍼 700μL을 추가하여 시료를 세척합니다. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.
- 선택적으로, 항체 염색 후, 시료는 플로우 버퍼에서 2% 파라포름알데히드의 500 μL로 고정될 수 있다. 실온에서 15분 동안 샘플을 수정합니다. 이어서, 4.10에 기재된 대로 한 번의 세척을 수행한다. 고정 샘플을 4°C에 저장합니다. 카운트 구슬은 흐름 세포 측정 데이터 수집 당일에 추가되어야 합니다. 고정 된 샘플은 1-2 일 동안 유동 세포계에서 실행해야합니다.
주의: 파라포름알데히드는 부식성 및 건강 상의 위험입니다. - 차가운 흐름 버퍼 500 μL을 사용하여 샘플을 다시 세척하십시오. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류체의 절반을 흡인시합니다.
- 펠릿을 다시 중단하고 96 우물, U-바닥 분석 플레이트로 전송합니다. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기 플레이트. 상류제를 장식하려면 접시를 뒤집어 한 번의 강한 흔들림으로 액체를 싱크대 분지로 빼내고 펠릿을 방해하지 마십시오.
- 새로운 1.2 mL 마이크로 티터 튜브에 잘 소용돌이 카운트 구슬의 50 μL을 배치합니다.
- 콜드 플로우 버퍼의 200 μL에서 96 개의 웰 플레이트에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이전 단계에서 구슬 위에 셀 혼합물을 추가합니다. 250 μL /마이크로 티터 튜브의 총 부피로 유동 세포계에서 실행합니다.
5. 유동 세포측정 데이터 수집
- 켜고 흐름 세포계를 준비합니다. 여기에 나열된 지침은 수정된 4개의 레이저 사이토미터(표2)에대한 것입니다.
- 각 샘플의 작은 알리쿼트가 포함된 테스트 샘플을 실행하여 각 검출기에 대해 모든 세포가 스케일에 있는지 확인합니다. 모든 셀이 스케일에 있도록 전압을 조정합니다.
- 염색 칵테일(표3)에사용되는 모든 불소에 대해 단일 색상 컨트롤(SCC)을 실행합니다. 마이크로 티터 튜브를 더 큰 5mL 폴리스티렌 튜브에 넣고 유동 세포계 단계에 배치합니다.
참고: BV421(퍼시픽 블루), FITC, PE, Alexa647(APC), 알렉사700과 같은 루트 형광은 칵테일과 동일한 항체를 필요로 하지 않습니다(즉, CD64 PE용 CD19 PE). 그러나, PE-CF594, PE-Cy7 또는 APC-Cy7과 같은 탠덤 형광은 공주형 형광의 잠재적 해리로 인한 칵테일과 같은 SCC에 대해 동일한 항체를 필요로 한다.- 햄스터 안티 마우스 CD11c BV421의 1 μL과 함께 1.2 mL 티터 튜브에 2 방울의 보정 구슬을 추가하여 BV421에 대한 SCC를 만듭니다. 보상 구슬은 CD11c BV421이 5.3.3에 설명된 바와 같이 카파가 아닌 IgG 람다 하위형이기 때문에 사용된다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.
- 아민 반응성 구슬에서 1방울의 포지티브 염색 구슬(녹색 캡)을 추가하고 라이브/데드 염료 1μL을 추가하여 라이브/데드 염료에 대한 SCC를 만듭니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 아민 반응성 구슬에서 음수 구슬(흰색 캡)을 한 방울 더 넣습니다. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.
- 안티래트 및 항햄스터 Ig 카파 비드 세트에서 양성 염색 구슬(green cap)의 한 방울을 첨가하고, 1.2mL 티터 튜브에 나열된 항체 수량(표3)을첨가하여 나머지 SCC를 생성한다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 안티 랫과 안티 햄스터 이그 카파 구슬 세트에서 네거티브 구슬 (흰색 모자)의 한 방울을 추가합니다. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.
- 소용돌이 모든 비드 혼합물은 완전히. 최대 3 일 동안 4 °C에서 SCC를 저장합니다.
참고: 형광 기자 마우스에 대한 SCC는 얼룩이 없는 세포입니다. - SCC를 실행할 때, SCC 샘플이 동일한 검출기 채널의 세포 샘플에 대한 형광보다 큰 피크를 가지는 것과 같은 전압을 설정합니다. 또한, 모든 SCC가 관심 채널의 히스토그램 피크와 다른채널(그림 1)의히스토그램 피크 사이에 최소 0.5 로그 차이가 있도록 전압을 설정해야 합니다.
- "낮은" 유지 이벤트/초 아래 4000에서 샘플을 실행합니다. 유량을 적절히 낮출 수 없는 경우 추가 냉류 버퍼로 샘플을 희석합니다. 카운트 계산에 필요한 볼륨을 기록합니다(대표 결과 참조).
- 샘플당 최소 3 x 106 이벤트를 수집합니다. 이것은 당신의 세포계에 사건으로 계산하는 안료 과립 및 파편 때문에 세포 수 보다는 더 높을 지도 모릅니다.
- 6.4항에서 적절한 게이팅 전략에 대해 라이브/데드 이외의 각 형광에 대해 형광 마이너스 원(FMO)을 기록합니다. FMO는 하나를 제외한 모든 형광으로 염색된 샘플입니다.
- 제조업체 또는 시설 지침에 따라 흐름 사이토미터를 청소하고 종료합니다.
6. 유동 세포측정 데이터 의 화형
- 분석 소프트웨어를 사용하여 새 워크시트를 엽니다. 모든 샘플 및 단일 색상 컨트롤에 대해 사이토미터에서 FCS 파일을 가져옵니다.
- SCC를 사용하여 보상 행렬을 만듭니다.
- 얼룩진 샘플 및 FmOs에 보상 매트릭스를 적용합니다.
- FmOs를 사용하여 게이트를 그리는 양색 얼룩을 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 1은 적색 레이저용 SCC 및 세포에 대한 보상되지 않은 주파수 히스토그램을 보였다: Alexa647, Alexa700, 및 APC-Cy7. 도 1A에서,마젠타 라인은 Alexa647에 대한 SCC의 피크를 묘사하고, 시안 선은 의도된 0.5 로그 차이를 나타냈다. Alexa700 및 APC-Cy7의 피크는 시안 선의 왼쪽(덜 밝은)에 있었다는 점에 유의하십시오. 또한 세포는 모두 마젠타 선의 왼쪽에 있었다는 점에 유의하십시오. SCC 피크의 오른쪽에 있는 모든 세포는 보상되지 않았습니다. 특정 채널은 플루오로크롬 염료의 화학에 기초하여 다른 채널로 유출하는 것으로 알려졌다(즉,. 바이올렛 레이저: BV421 -> V500, 옐로우 그린 레이저: PE-> PE-CF594, 레드 레이저: Alexa647 -> Alexa700, Alexa700 -> APC-Cy7, 크로스 레이저: PE-Cy7 -> APC-Cy7). 위의 조건 중 하나가 충족되지 않으면 유출 채널을 아래로 이동할 수 있는 동안 한 채널의 전압을 위쪽으로 조정할 수 있습니다. 빨간색 레이저의 추가 예는 그림 1B 및 도 1C를 참조하십시오. 전압이 결정된 다음 기록되면 모든 샘플을 전압 파라미터로 실행해야 합니다. 보정 설정 마법사가 존재하며 도움이 될 수 있습니다.
셀 카운트의 정량화에는 구단 식별 카운트가 필요합니다. 도 2A는 단일 마우스의 두 눈에서 모든 분석 된 이벤트에 대한 FSC-A 대 SSC-A 속성을 보였다. SSC 전압을 조정하여 SSC-A하이 및 FSC-A로우 이벤트의 매우 타이트한 컬렉션으로 계산 구슬이 표시되는지 확인하는 것이 중요합니다. 비드 카운트는 PE 대 APC-Cy7(도 2B)을 플로팅하여 세척및 확인하였다. 깨끗한 구슬은 PE+ 및 APC-Cy7의 단단한 클러스터였습니다- 이벤트.
싱글트와 라이브 셀은 모든 이벤트에서 다음에 확인되었습니다. 싱글트는 FSC-H 대 FSC-A플롯에 의해 결정되었다. 싱글트는 이중 및 삼중 세포가 FSC-H(도 2C)보다더 큰 FSC-A를 가진 동안 이 두 속성에서 긍정적으로 상관관계가 있었습니다. 라이브 셀은 라이브 / 죽은 대 FSC-A를 플로팅하여 묘사되었다. 죽은 세포는 살아있는 / 죽은 양성, 세포는 파편 (도 2D)보다 더 큰 FSC-A를 시연했다. 구슬 수는 라이브 / 죽은+이며이 단계에서 제거되었습니다.
도 3은 살아있는 단일 세포로부터 단핵 phagocytes의 묘사를 위한 초기 게이팅 전략을 나타낸다. 라이브 싱글은 CD45 대 CD11b플롯(그림 3,왼쪽)을 사용하여 시각화하였다. CD45+CD11b- (주로 B 세포 및 T 세포), CD45딤CD11b+ (putative microglia), 및 CD45+CD11b+ 세포 (면역 세포 침투, 레이저 [도 3B, 왼쪽]로 증가) 선택되었다. CD45 FMO에서CD45+ 세포의 부재는 게이트 선택을 확인하였다(도3C,왼쪽). 다음으로, 호중구, 호산구, B 세포, NK 세포 및 T 세포는 리니지 게이트 (Lin: Ly6G [호중구], SiglecF [호산구], B220 [B 세포], NK1.1 [NK 셀], CD4 [T 세포], CD-1[T-세포]를 사용하여 CD45+ 살아있는 싱글을 플로팅하여 제외되었습니다. CD11b+린-노 레이저(도3A,중간) 및레이저(도 3B,중간) 사이의 세포의 증가는 쉽게 관찰되었다. CD11b+린 셀의 부족을 참고CD11b FMO(도 3C,중간) 및 Lin FMO에서 린+ 세포의 부족(도 3C,오른쪽). 마이크로글리아는 CD45발현(13,24)의양에 의해 단핵 세포에 침투하는 것을 분리할 수 있다. CD11b+린- 세포는 CD11b 대 CD45 플롯을 사용하여 CD45딤퍼티 마이크로글리아 및 CD45높은 침투 단핵 phagocytes를 식별하도록 시각화하였다. CD45고단핵 세포의 상대적 증가는 레이저 처리 마우스(도3A, B,오른쪽)에서 분명했다.
도 4는 마이크로글리아, 3개의 대식세포 서브세트, 단핵구 및 수지상 세포를 확인하였다. 마이크로글리아는 CD64 대 MHCII플롯(도 4,왼쪽 패널)에 CD45딤셀을 플로팅하여 결정하였다. 마이크로글리아는 CD64+MHCII낮은 이전에13로나타났습니다. 마이크로글리아는 레이저로 상대적으로 변하지 않았고 CD64 FMO(그림4A, C 왼쪽)에 결석했다. CD45높은 셀은 MHCII 그래프 대 동일한 CD64에 다음 플롯하였다. CD64+MHCII- 대식세포 (MHCII- 맥), CD64-MHCII- 단핵구 및 MHCII+ 세포가 확인되었다(그림 4A, B,중간 왼쪽). MHCII FMO(그림4C,왼쪽 가운데)에서 MHCII+ 세포의 부재를 유의한다. MHCII+ 세포는 CD64 및 CD11c. CD64+CD11c- 대식세포 (CD11c- 맥), CD64 + CD11c+CD11c+ 대식세포 (CD11c+ 맥), 및 CD64-CD11c+ 수지상 세포 (DC)를 사용하여 추가로 구별되었다(그림 4A, B,오른쪽 중간). CD11c FMO(도4C,가운데 오른쪽)에서 CD11c+ 셀의 부재를 유의한다. 단핵구는 고전 Ly6C+ 또는 비고전 Ly6C로 아형화되었다- 모노사이클(그림 4,오른쪽). Ly6C FMO에서 Ly6C+ 단핵구의 부재를 유의하십시오(그림 4C,오른쪽).
마우스당 세포 수(또는 눈 2개당)는 다음과 같은 방정식으로 계산하였다.
이 메서드의 볼륨을 사용하여 방정식은 다음과 같은 것입니다.
셀 수와 비드 카운트는 각 샘플에 따라 다릅니다. 구슬의 농도는 각 바이알에 제조 업체에 의해 제공 카운트 구슬의 각 많은에 특정.
대식세포는 레이저 부상 후 코로이드에침투(25)하고,대식세포 고갈은 CNV영역(18)을감소시킨다. 이 오래된 연구 결과는 단핵 phagocytes, 또는 대식세포 식별을 위한 더 적은 유동 세포 측정 마커를 안정적으로 구별할 수 없는 면역 형광 화상 진찰에 의지합니다. 대식세포 이질성은 대식세포가 그들의 기원과 조직미세환경(12,26)에따라 다중 기능을 수행할 수 있는 타고난 면역학에서 새로운 개념이다. 레이저 부상 후 3일째에 처리되지 않은 레이저 처리 마우스 눈에 다중 파라미터 유동 세포측정을 수행하여 단일핵 교핵 세포및 대식세포 이질성을 확인했습니다. 레이저 치료는 MHCII를 증가-,CD11c-및 CD11c+ 대식세포7.0-25.6, 2.8-7.2, 및 3.9-8.2 배 각각(그림 5A,C). 수지상 세포 수는 또한 레이저에 의해 4.5-4.7배(도 5F)를최대 조절하였다. 마이크로글리아 및 단세포 수는 레이저처리(그림 5D, E)에의해 영향을 받지 않았다. 유의한 차이는 enucleation 이전에 전신 관류의 유의한 차이가 검출되지 않았다. 이러한 결과는 마이크로글리아 또는 단핵구에 대한 변화가 없는 레이저 부상 후 증가된 대식세포 집단 및 수지상 세포를 보여줍니다. 또한 이러한 데이터는 다중 파라미터 흐름 세포측정이 대식세포 이질성을 감지하는 방법을 강조합니다.
| 항체 또는 완충제 | 플루오로포레 | 복제 | 샘플당 양(ng) |
| 쥐 안티 마우스 Ly6C | Fitc | AL-21 | 15 |
| 마우스 안티 마우스 CD64 | Pe | X54-5/7.1 | 40 |
| 쥐 안티 마우스 팀4 | 알렉사플루어 647 | RMT4-54 | 300 |
| 햄스터 안티 마우스 CD11c | BV 421 | HL3 | 300 |
| 쥐 안티 마우스 Ly6G | PE-CF594 | 1A8 | 10 |
| 마우스 안티 마우스 NK1.1 | PE-CF594 | PK136 | 10 |
| 쥐 안티 마우스 시그렉 F | PE-CF594 | E50-2440 | 20 |
| 쥐 안티 마우스 B220 | PE-CF594 | RA3-6B2 | 20 |
| 쥐 안티 마우스 CD8 | PE-CF594 | 53-6.7 | 40 |
| 쥐 안티 마우스 CD4 | PE-CF594 | RM4-5 | 20 |
| 쥐 안티 마우스 MHC II | 알렉사플루어 700 | M5/114.15.2 | 2.5 |
| 쥐 안티 마우스 CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 2 |
| 쥐 안티 마우스 CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 6 |
| MACS 버퍼 |
표 1: 항체 불소및 클론(4.9단계 참조). 일반적으로 한 가지 샘플은 하나 또는 두 개의 소화된 눈입니다. 각 항체를 먼저 튜브에 흐름 버퍼를 추가합니다. 총 흐름 버퍼 볼륨을 적절하게 변경하면서 볼륨이 너무 작은 파이펫팅을 방지할 수 있습니다. 제품 번호 및 회사에 대한 재료 표를 참조하십시오.
| 레이저 | PMT 슬롯 | 필터 | 거울 | 색상 |
| 바이올렛 (405nm) | A | 525/50 | 505LP | V500 또는 암시안 |
| B | 450/50 | 퍼시픽 블루, 에플루어 450, V450 또는 BV421 | ||
| 블루(488nm/FSC) | A | 710/50 | 685LP | PerCP-Cy5.5, PerCP, PI 또는 7AAD |
| B | 525/50 | 505LP | FITC, CFSE, GFP 또는 알렉사플루어 488 | |
| C | 488/10 | Ssc | ||
| 옐로우 그린 (561nm) | A | 780/60 | 735LP | PE-Cy7 |
| B | 610/20 | 600LP | PE-CF594, mCherry 또는 DsRed2 | |
| C | 582/15 | Pe | ||
| 레드(640nm) | A | 780/60 | 735LP | APC-Cy7, APC-H7 또는 APC-eFluor 780 |
| B | 730/45 | 690LP | 알렉사플루어 700 | |
| C | 670/30 | APC 또는 알렉사플루어 647 |
표 2: 유동 세포계 구성. 4레이저 사이토미터및 각 채널에서 검출할 수 있는 사용 가능한 형광계를 위한 필터 및 미러 설정. PMT = 광승화 튜브, FSC = 전방 분산, SSC = 측면 분산.
| 항 체 | 플루오로포레 | 복제 | SCC당 금액(ng) |
| 쥐 안티 마우스 CD45 | Fitc | 30-F11 | 500 |
| 쥐 안티 마우스 CD19 | Pe | 1D3 | 40 |
| 쥐 안티 마우스 팀4 | 알렉사플루어 647 | RMT4-54 | 100 |
| 햄스터 안티 마우스 CD11c | BV421 | HL3 | 200 |
| 쥐 안티 마우스 시그렉 F | PE-CF594 | E50-2440 | 40 |
| 쥐 안티 마우스 CD19 | 알렉사플루어 700 | 1D3 | 200 |
| 쥐 안티 마우스 CD11b | APC-Cy7 | M1/70 | 200 |
| 쥐 안티 마우스 CD45 | PE-Cy7 | 30-F11 | 200 |
| 라이브 / 죽은 염료 | 에플루어 506 | N/A | 1 μl |
표 3: 단일 색상 컨트롤용 항체 불소 및 클론. 각 항체는 5.3.1 - 5.3.3 단계에 설명된 대로 적절한 보상 비드에 첨가되어야 한다.
그림 1: 빨간색 레이저에 대한 대표 전압 설정. (A)Alexa647의 단일 색상 컨트롤(SCC). 왼쪽에는 Alexa647용 SCC가 표시됩니다. 왼쪽 중간알렉사647 SCC의 유출을 Alexa700 채널로 표시합니다. Alexa647 SCC의 피크는 마젠타에 표시되고 0.5 로그 목표 차동이 시안으로 표시됩니다. 피크는 시안 선보다 왼쪽(덜 밝은)입니다. 중앙 오른쪽은 APC-Cy7 채널로 Alexa647 SCC의 유출을 보여줍니다. 오른쪽은 Alexa647 채널의 세포를 보여 줍니다. 모든 세포는 SCC(마젠타 선)보다 덜 밝습니다. (B)알렉사700SCC. 중앙 왼쪽은 Alexa700에 대한 SCC를 보여줍니다. 왼쪽은 Alexa647 채널에 Alexa700 SCC의 유출을 표시합니다. 중앙 오른쪽은 APC-Cy7 채널에 Alexa700 SCC의 유출을 보여줍니다. Alexa700 SCC의 피크는 마젠타에 표시되고 0.5 로그 목표 차동이 시안으로 표시됩니다. 피크는 시안 선보다 왼쪽(덜 밝은)입니다. 오른쪽은 Alexa700 채널의 세포를 보여 줍니다. 모든 세포는 SCC(마젠타 선)보다 덜 밝습니다. (C)APC-Cy7용 SCC. 왼쪽과 중앙 왼쪽 알렉사647 및 Alexa700으로 APC-Cy7 SCC의 유출을 각각 보여줍니다. 두 피크는 모두 시안 선의 왼쪽에 있습니다. 가운데 오른쪽은 ACP-Cy7 SCC를 보여줍니다. 오른쪽은 APC-Cy7 채널의 세포를 보여 줍니다. 모든 세포는 SCC(마젠타 선)보다 덜 밝습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 카운트 구슬, 싱글, 라이브 셀의 대표적인 식별. (A)등고선 플롯의 모든 셀에 대한 측면 산란 영역(SSC-A) vs 전방 산란 영역(FSC-A). 카운트 구슬은 높은 SSC-A, 낮은 FSC-A 및 균일 한 구슬의 매우 꽉 클러스터링에 의해 식별됩니다. (B)깨끗한 비드 게이트에 대한 APC-Cy7 플롯 대 PE. A와 B 사이의 화살표는 카운트 비드 양수 이벤트만 플로팅했음을 나타냅니다. 클린 카운트 구슬은 높은 PE와 낮은 APC-Cy7 형광에 의해 묘사됩니다. (C)FSC-Height(FSC-H) vs FSC-Area(FSC-A) 플롯은 양호한 상관관계 넓은 선에서 단일 세포를 시연한다. 더블 및 기타 멀티플렉스는 FSC 높이보다 FSC-Area를 더 많이 표시합니다. (D)싱글 셀에 대한 라이브 / 죽은 대 FSC-A. 라이브 셀은 라이브 /죽은 낮은 및 FSC-A 양성으로 정의됩니다. 백분율은 상위 의 백분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단일 핵 세포의 대표적인 식별. 왼쪽: CD45 대 CD11b 의사색 플롯은레이저(A),레이저(B),및 형광에서 1개(FMO) 대조군(C)을 뺀 것으로 서있다. 왼쪽: CD45+ 셀은 A-B로 정의되고 FMO에 존재하지 않습니다. 레이저(B)군에서CD45+ CD11b + 세포의 증가를 주목한다. 중간: CD45+ 셀에 대한 계보 (린) 마커 대 CD11b의 의사 색상 플롯. CD11b+린- 세포는 A-B로 묘사되고 CD11b (아래)에 대한 FMO에 없습니다. 오른쪽: CD11b 대 CD11b+린- 셀의 CD45 플롯. CD45딤 및 CD45높은 셀이 식별됩니다. 레이저(B) 그룹에서 CD45높은 셀의 증가를 유의한다. 백분율은 상위 의 백분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마이크로글리아, 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포 하위 집합의 대표적인 식별. 왼쪽: CD64 vs MHCII 의 의사 컬러 플롯 의 CD45딤 셀은 마이크로글리아를 CD64+MHCII로우로정의합니다. 레이저(A)및레이저(B)군에서 마이크로글리아의 유사한 양과 FMO제어(C)에서마이크로글리아의 부재를 유의한다. 왼쪽 중간: CD64 대 MHCII 의 의사 컬러 플롯CD45하이 셀은 MHCII- 대식세포 - CD64+MHCII로, 단핵구는 CD64 - MHCII-및 MHCII+ 세포를 정의합니다. 레이저 군(B)의 MHCII-대식세포의 증가, FMO(C, 중간)에 MHCII+ 세포의 부재, CD64 FMO(C, 왼쪽)가 CD64+ 및 CD64-세포에 대한 차단을 결정하는 데 도움이 되었다. 오른쪽 중간: CD64 vs CD11c 의사색상 플롯의 MHCII+ 셀. CD11c- 대식세포는 CD64+CD11c로 정의되었다-CD11c+ 대식세포는 CD64+CD11c+ 및수지상 세포(DC)로 식별되었다 CD64-CD11c+. 대식세포 서브셋과 수지상 세포는 모두 레이저(B)로 증가하였다. FMO(C)에 CD11c+ 셀이 없다는 점에 유의하십시오. 오른쪽: Ly6C vs Tim4 의사컬러 플롯의 단핵구. 고전 Ly6C+ 및 비 고전 Ly6C- 단핵구가 확인되었다. Ly6C FMO(C)에는 클래식 Ly6C+ 단핵구가 존재하지 않았습니다. 백분율은 상위 의 백분율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 전신 관류의 유무에 관계없이 레이저되지 않은 마우스와 레이저마우스 사이의 단일 핵 세포에 대한 대표적인 데이터. MHCII- (A),CD11c- (B),및 CD11c+ (C)대식세포 수는 모두 레이저로 증가하였다. 레이저및 레이저마이크로글리아(D)또는 단핵구(E) 사이에는 변화가 감지되지 않았다. 수지상 세포(DC)도레이저(F)로증가하였다. 던넷의 T3 다중 비교 테스트를 통해 브라운 포지테와 웰치 ANOVA는 그룹 간의 불평등한 차이로 인한 통계적 차이를 정의하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
다중 파라미터 유동 세포측정은 복잡한 조직에서 다중 세포 유형의 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 보고서에서는 마우스 눈의 레이저 부상 후 단핵 세포, 수지상 세포 및 대식세포 서브셋을 포함한 단일 핵 세포 개체 개체 집단의 유동 세포 측정 검출을 설명합니다. Liyanage 등은 최근 호중구, 호산구, 림프구, DC, 대식세포, 침투 대식세포 및단핵구(27)를검출하기 위한 유사한 게이팅 전략을 보고했다. 우리의 게이팅 전략은 주로 CD64의 추가에 의해 다릅니다. Liyanage 등은 DC를 CD4 -CD8-B220-CD11b+CD11c+ 세포, 및 대식세포CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- 셀로 식별합니다. 우리는CD4로DC를 식별 - CD8-B220-Ly6G-시글렉프-NK1.1-CD11c+CD64- 세포 및 대식세포CD4-CD8-B220-Ly6G-시글렉프-NK1.1-CD11b + CD64+셀. 대식세포에서 DC를 구별하기 위해 CD64를 사용하는 것은 잘설립6,이 전략은 우리가 CD11c + 대식 세포주를 포함하여 대식 세포 이질성을 식별 할 수 있습니다. 이 방법의 주요 한계는 조직 아키텍처 또는 눈 내의 특정 세포의 위치에 대한 데이터를 제공하지 않는다는 것입니다. 이러한 세포가 망막, 코로이드, 홍채 또는 다른 안구 구조에 있는지 여부를 결정하기 위해, 우리의 프로토콜은 조직학적 방법과 결합되거나 각 안구 서브컴파트어획에서 다중 파라미터 흐름 세포측정을 개별적으로 실행하기 위해 보다 광범위한 안과 해부를 포함하도록 변형될 수 있다.
우리는 해부에 의해 생성 된 모든 차이를 방지하기 위해 전체 마우스 눈의 소화를위한 프로토콜을 최적화했습니다. 예를 들어, 각막, 홍채 및 렌즈를 제거하는 후방 눈 컵의 해부는 유지된 홍채 또는 각막 물질(아래 해부) 또는 일반 후방 눈컵 영역(과다 해부)으로 레이저 부상을 증가시키는 가변성을 만들 수 있습니다. 레이저가 없는 제어와 레이저 눈 사이의 비교는 망막 손상으로 인해 단일 핵 phagocytes의 침투를 감지합니다. 눈에 전신 질환의 효과의 분석을 위해, 즉, 방비염과 당뇨병, 개별 안구 하위 구획 분석은 필수적이다. 프로토콜의 섹션 2에서 소화 방법은 가장 중요하며, 섹션 3 - 5의 다른 단계는 다중 조직 유형24에서성공적으로 사용되었습니다. 우리는 관련된 반복적 인 방법을 통해 소화 조건에 도달했습니다 : (1) 화학 소화 방법 (콜라게나아제 D 대 소화 효소), (2) 화학 소화의 길이 의 결정 (30, 60 및 90 분), (3) 기계적 소화의 추가 (없음, 한 번, 두 번, 세 번). 각 단계에서 우리는 세포 생존력과 CD45HiCD64+ (대식세포 침투) 세포의 수에 의해 소화 조건의 성공을 판단했습니다. 우리는 소화 효소 (재료의 보충 표 참조) 콜라게나아제 D보다 더 많은 라이브 세포를 복구하고 소화 효소 농도의 절반을 시도하면 더 적은 침투 대식세포가 발생한다는 것을 발견했습니다. 다음으로, 기계적 소화로 화학 소화의 60 분은 침투 대식세포 인구를 거의 두 배로. 3개의 기계소화는 단색의 25-30% 살아있는 세포 및 가장 침투하는 대식세포 집단으로 최적이었습니다. 마지막으로, 더 빠른 기계적 소화 조건은 살아있는 세포와 대식세포 둘 다의 가혹한 손실을 일으키는 원인이 되었습니다.
앞으로는 각막, 홍채, 렌즈를 제거하고 망막과 후방 안구(clera, choroid 및 망막 색소 상피)를 별도로 소화하여 방법을 확장할 것을 제안합니다. 이러한 수정을 통해, 우리는 각각 렌즈와 각막의 단백질과 조밀한 특성 때문에 소화 상태를 감소시킬 것으로 기대합니다. 이러한 감소는 감소 된 소화 효소 농도 포함 될 수 있습니다., 콜라게나아제로 전환, 소화의 감소 시간, 또는 기계적 소화의 감소 된 금액. 우리는 후방 눈 컵에 대 한 전반적인 감소 된 소화 조건을 기대, 그리고 더 감소 된 소화 조건 만 망막에 대 한.
추가 미래 방향은 기존의 6 레이저 계측기 또는 스펙트럼 흐름 세포측정에 우리의 기존의 다중 파라미터 흐름 세포측정 패널의 확장을 포함한다. 스펙트럼 흐름 세포측정은 사용 가능한 필터에 의해 결정되는 것이 아니라 전체 스펙트럼에 걸쳐 형광경 검출을 허용합니다. 스펙트럼 흐름 세포측정은 보다 구체적인 색상 검출을 초래합니다. 그러나 스펙트럼 흐름 세포 측정을 위해서는 완전히 새로운 고려 사항이 필요하며 이 원고의 범위를 벗어납니다. 자세한 내용은 이 최근 JoVE 기사28을참조하십시오. 6 개의 레이저 기기에는 자외선 레이저가 포함되어 있어 6-9 검출기를 추가합니다. 마우스 눈 유동 세포측정패널에 마커를 추가할 때 는 더 많은 안구 세포 유형을 감지하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 리니지 게이트는 호중구, 호산구, 비만 세포, NK 세포 및 림프구를 독립적으로 검출하기 위해 분리될 수 있다. 정상 상태에서 소수의 대식세포 때문에 단핵 phagocytes의 하위 집합 검출을 증가시키지 않는 것이 좋습니다. 새로운 항체를 추가할 때, 우리는 주의깊은 항체 적정을 건의합니다.
요약하자면, 우리는 마우스 눈에서 단핵 phagocyte 인구의 검출을 위한 적응가능하고 견고한 방법을 제시했습니다. 단핵구, 수지상 세포, 대식세포 및 마이크로글리아의 매우 겹치는 세포 표면 마커로 인해 다중 파라미터 흐름 세포측정법은 이러한 세포 집단을 검출하는 가장 좋은 방법입니다. 유동 세포분석은 전사 또는 프로테오믹 평가를 위한 세포 모형, 운명 매핑 및/또는 세포 분류의 분석에 사용될 수 있다. 그것의 주요 한계는 조직 건축의 부족이고, 중요한 사실 인정은 전통적인 조직학을 사용하여 확인할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
JAL은 NIH 보조금 K08EY030923에 의해 지원되었다; CMC는 NIH 국립 관절염 및 근골격계 질병 연구소의 K01 교부금(5K01AR060169)과 루푸스 연구 연합의 참신연구보조금(637405)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J.
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
