Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi
Summary
Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu dahil olmak üzere oküler patofizyolojide önemli roller oynar. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, özellikle mononükleer fagositler, üst üste binen hücre yüzey belirteçlerini ifade eder, bu da bu popülasyonları tanımlamayı zorlaştırır. Çok parametreli akış sitometrisi, fare gözlerindeki monositleri, makrofajları, mikrogliaları ve dendritik hücreleri ayırt etmek için birden fazla hücre yüzey belirtecinin eşzamanlı, nicel analizine izin verir. Bu protokol, tüm fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek bir hücre süspansiyonuna sindirimi ve miyeloid hücre belirteçleri için tek hücre süspansiyonunun lekelenmesini açıklar. Ek olarak, tek renk kontrolleri kullanarak voltajları belirlemek ve floresan eksi bir kontrol kullanarak pozitif kapıların sınırlandırması için uygun yöntemleri açıklıyoruz. Çok parametreli akış sitometrisinin en önemli sınırlaması doku mimarisinin olmamasıdır. Bu sınırlama, bireysel oküler bölmelerin çok parametreli akış sitometrisi veya ücretsiz immünoresans lekeleme ile aşılabilir. Bununla birlikte, immünofluoresans, nicel analiz eksikliği ve çoğu mikroskopta florofor sayısının azalması ile sınırlıdır. Lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyonda mononükleer fagositlerin yüksek nicel analizini sağlamak için multi-parametrik akış sitometrisinin kullanımını açıklıyoruz. Ayrıca, çok parametreli akış sitometrisi, transkriptomik veya proteomik çalışmalar için makrofaj alt kümelerinin tanımlanması, kader haritalaması ve hücre sıralama için kullanılabilir.
Introduction
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi, kompleman aktivasyonunu ve iltihabı uyaran birden fazla hücre tipi içerir. Doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasında doğal öldürücü (NK) hücreler, mast hücreleri, bazofiller, eozinofiller, nötrofiller ve mononükleer fagositler bulunur. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerden oluşan mononükleer fagositler, üveit, diyabetik retinopati ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) dahil olmak üzere birden fazla oftalmik durum patofizyolojisinde yer1. Bu protokolde, neovasküler AMD2’ninbir fare modelinde çok parametreli akış sitometrik analizi kullanarak mononükleer fagositlerin tanımlanmasına odaklanacağız. Bu protokol diyabetik retinopati ve/veya üveit fare modelleri için uyarlanabilir, ancak bu hastalıkların sistemik doğası nedeniyle daha kapsamlı oküler diseksiyon önerilir.
Mononükleer fagositler çakışan hücre yüzeyi işaretleyicilerini ifade eder. Uzun ömürlü doku yerleşik makrofajlar ve mikroglia yumurta sarısı kese türevi eritromileoid progenitor3‘ten kaynaklanırken, makrofajların ve dendritik hücrelerin geri dönüşümü kemik iliği türevi makrofaj dendritik hücre progenitor4’tenfarklıdır. Monositler, makrofajlar ve dendritik hücrelerde ortak olan fare hücresi yüzey işaretçileri CD45, CD11b5, F4/806, Cx3cr17ve hücre içi işaretleyici Iba18 ‘iiçerir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, birden fazla dokudan gelen makrofajların, monositlerin ve dendritik hücrelerin transkriptomik analizi CD64’ü makrofaja özgü bir hücre yüzeyi işaretleyicisi olarak tanımlar6. Makrofajlar sağlıklı gözlerde iris, koroid, silier vücut ve optik sinirde tanımlanmıştır3. Alternatif olarak, dendritik hücre tanımlaması daha zordur; dendritik hücre tanımlamanın en özel yöntemi, Zbtb46-GFP muhabirfaresi 9kullanılarak kader eşlemesi gerektirir. Bu muhabir satırından bağımsız olarak, CD64 yokluğu ile birlikte CD11c ve MHCII ifadesi potansiyel dendritik hücreleritanımlayabilir 6,10. Normal gözlerde kornea, konjonktiva, iris ve koroidde dendritik hücreler tanımlanmıştır11. Mikroglia retinada bulunan, kan-retina bariyeri ile korunan ve yumurta sarısı kesesi progenitör hücrelerinden elde edilen özel makrofajlardır12. Sonuç olarak, retinal mikroglia monosit türevi makrofajlardan CD45 ekspresyon13 loş seviyeleri ve akış sitomemetri antikoru 14 olarak kullanılabilen yüksek Tmem119 seviyeleri ile ayırt edilebilir. Bununla birlikte, mikroglia aktivasyonu üzerine, CD45 yukarı regüle edilebilir15 ve Tmem119 aşağı düzenlenmiş olabilir3Mikroglia biyolojisinin karmaşıklığını gösteren ve bu muhtemelen hem AMD hem de fare modelinde geçerlidir. Son olarak, monositler klasik ve klasik olmayan dahil olmak üzere en az iki alt tipe ayrılabilir. Klasik monositler CCR2+Ly6CyüksekCX3CR1düşük ifadesini gösterir ve klasik olmayan monositler CCR2–Ly6CdüşükCX3CR1yüksek işaretleyicilerigösterir 5.
İşaretçi ekspresyonunun nicel analizinin gerekliliği nedeniyle, yani yüksek ve düşük/loş seviyeler, çok parametreli akış sitometrisi, göz ve diğer dokulardaki monositler, makrofajlar, mikroglia ve dendritik hücreler arasında ayrımcılık için ideal bir yöntemdir. Ek avantajlar arasında alt popülasyonların tanımlanması, hücre popülasyonlarını transkriptomik veya proteomik analiz için sıralamak için floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanma yeteneği ve kader haritalaması saydır. Çok parametreli akış sitometrisinin en büyük dezavantajı doku mimarisinin olmamasıdır. Bu, oftalmik diseksiyonun çeşitli oküler alt bölümlere girmesiyle aşılabilir: kornea, konjonktiva, iris, lens, retina ve koroid-sklera kompleksi. Ek olarak, doğrulayıcı immünofluoresans görüntüleme yapılabilir, ancak belirteç sayısı ve sağlam miktar eksikliği ile sınırlıdır.
Genom geniş ilişki çalışmaları AMD16ile birden fazla tamamlayıcı gen bağlamaktadır. Kompleman aktivasyonu anafilatoksin üretimine, lökosit alımına ve ortaya çıkan iltihaplanmaya yol açar. Kompleman reseptör eksikliği olan farelerde lazer yaralanması mononükleer fagosit alımını ve lazer kaynaklı koroidal neovaskülarizasyon (CNV) alanını azaltır17. Benzer şekilde, dokuya monosit alımında eksik olan C-C motifli kemokin reseptörü 2 (CCR2) nakavt faresi, hem mononükleer fagosit alımının azaldığını hem de lazer kaynaklı CNV alanı18. Bu veri bağlantısı, deneysel CNV ve muhtemelen neovasküler AMD ile mononükleer fagositleri tamamlar ve tamamlar. Bu ilişkiyi desteklemek için, kompleman reseptörleri neovasküler AMD19,20olan hastalarda periferik kan monositleri üzerinde disregüle edilir. Bu veriler AMD ve mononükleer fagositler arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermektedir.
Bu yazıda, çok parametreli akış sitometrisi kullanarak fare gözündeki mononükleer fagosit popülasyonlarını karakterize etmek için deneysel lazer kaynaklı CNV modelini kullanacağız. Lazer kaynaklı CNV, mevcut ilk hat neovasküler AMD tedavisinin etkinliğini gösteren neovasküler AMD’nin standart fare modelidir21. Bu protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu, oküler diseksiyonu, tek hücreli süspansiyona sindirimi, antikor boyama, tek renk kontrolleri kullanılarak lazer voltajlarının belirlenmesi ve floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanılarak gating stratejisini tanımlayacaktır. Lazer kaynaklı CNV modelinin ayrıntılı bir açıklaması için lütfen önceki bir yayına bakın22. Bu protokolü kullanarak mikroglia, monositler, dendritik hücreler ve makrofaj popülasyonlarını tanımlayacağız. Ayrıca, lazer kaynaklı CNV modeli içinde makrofaj alt kümelerini daha fazla tanımlamak için MHCII ve CD11c’yi kullanacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok parametreli akış sitometrisi, karmaşık bir dokudaki birden fazla hücre tipinin nicel analizini sağlar. Bu raporda, fare gözünde lazer yaralanmasından sonra monositler, dendritik hücreler ve makrofaj alt kümeleri de dahil olmak üzere mononükleer fagosit popülasyonlarının akış sitometrik tespitini açıklıyoruz. Liyanage ve arkadaşları son zamanlarda nötrofilleri, eozinofilleri, lenfositleri, DC’leri, makrofajları, sızan makrofajları ve monositleri tespit etmek için benzer bir gating strateji…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL, NIH hibesi K08EY030923 tarafından desteklendi; CMC, NIH Ulusal Artrit ve Kas-İskelet Hastalıkları Enstitüsü’nden K01 hibesi (5K01AR060169) ve Lupus Araştırma Birliği’nden Yeni Araştırma Hibesi (637405) ile desteklendi.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
