Matsmältning av hela musögon för multiparameterflöde cytometrisk analys av mononukleära faragocyter
Summary
Detta protokoll ger en metod för att smälta hela ögon till en enda cell suspension för multi-parameter flöde cytometrisk analys för att identifiera specifika okulär mononuclear phagocytic populationer, inklusive monocyter, mikroglia, makrofager och dendritiska celler.
Abstract
Det medfödda immunsystemet spelar viktiga roller i okulär patofysiologi inklusive druvhinneinflammation, diabetiker retinopati och åldersrelaterad makuladegeneration. Medfödda immunceller, särskilt mononukleära fagocyter, uttrycker överlappande cellytemarkörer, vilket gör identifiering av dessa populationer till en utmaning. Multiparameterflödescytometri möjliggör samtidig, kvantitativ analys av flera cellytans markörer för att skilja monocyter, makrofager, mikroglia och dendritiska celler i musögon. Detta protokoll beskriver enucleation av hela mus ögon, okulär dissekering, matsmältningen i en enda cell suspension och färgning av encelliga suspension för myeloisk cell markörer. Dessutom förklarar vi de rätta metoderna för att bestämma spänningar med hjälp av enfärgskontroller och för att avgränsa positiva grindar med fluorescens minus en kontroll. Den största begränsningen av multiparameter flöde cytometri är avsaknaden av vävnad arkitektur. Denna begränsning kan övervinnas genom multiparameter flöde cytometri av enskilda okulär fack eller gratis immunofluorescens färgning. Immunofluorescens begränsas dock av dess brist på kvantitativ analys och minskat antal fluorforer på de flesta mikroskop. Vi beskriver användningen av multi-parametriska flöde cytometri att ge mycket kvantitativ analys av mononuclear phagocytes i laser-inducerad choroidal neovascularization. Dessutom kan multiparameter flöde cytometri användas för identifiering av makrofag delmängder, öde mappning och cell sortering för transkriptomic eller proteomic studier.
Introduction
Det medfödda immunsystemet innehåller flera celltyper som stimulerar komplementaktivering och inflammation. Medfödda immunceller inkluderar naturliga mördarceller (NK), mastceller, basofiler, eosinofiler, neutrofiler och mononukleära fagocyter. Mononukleära fagocyter, som består av monocyter, makrofager och dendritiska celler, har varit inblandade i patofysiologin hos flera oftalmiska tillstånd inklusive druvhinneinflammation, diabetiker retinopati och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD)1. I detta protokoll kommer vi att fokusera på identifiering av mononukleära farocyter med hjälp av multiparameter flöde cytometrisk analys i en musmodell av neovaskulär AMD2. Detta protokoll är anpassningsbart för mus modeller av diabetiker retinopati och/eller druvhinneinflammation, men mer omfattande okulär dissekering rekommenderas på grund av den systemiska karaktären av dessa sjukdomar.
Mononukleära fagocyter uttrycker överlappande cellytans markörer. Långvariga vävnad bosatta makrofager och mikroglia härstammar från äggula säck-härledda erythromyeloid föregångare3, medan återvinning makrofager och dendritiska celler skiljer sig från benmärg-härledda makrofag dendritic cell föregångare4. Muscellsmarkörer som är gemensamma för monocyter, makrofager och dendritiska celler inkluderar CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17och den intracellulära markören Iba18. För att övervinna denna utmaning definierar transkriptomisk analys av makrofager, monocyter och dendritiska celler från flera vävnader CD64 som en makrofagspecifik cellytans markör6. Makrofager har beskrivits i iris, choroid, ciliary kropp och optik nerv i friska ögon3. Alternativt är dendritisk cellidentifiering svårare; den mest specifika metoden för dendritisk cellidentifiering kräver ödesmappning med hjälp av Zbtb46-GFP-reportermusen9. Oberoende av denna reporter linje, uttryck för CD11c och MHCII i samband med frånvaron av CD64 kan identifiera potentiella dendritiska celler6,10. Dendritiska celler har identifierats i hornhinnan, bindhinnan, iris och choroid i normala ögon11. Microglia är specialiserade makrofager som ligger i näthinnan, skyddade av blod-retinalbarriären, och härrör från äggula sac stamceller12. Som ett resultat kan retinal microglia skiljas från monocyt-härledda makrofager genom deras dim nivåer av CD45 uttryck13 och höga nivåer av Tmem119, som finns som ett flöde cytometry antikroppar14. Vid mikrogliaaktivering kan CD45 dock vara uppreglerad15 och Tmem119 kan vara nedreglerad3, vilket visar komplexiteten i mikrogliabiologi och detta är sannolikt relevant i både AMD och dess musmodell. Slutligen kan monocyter delas in i minst två undertyper, inklusive klassiska och icke-klassiska. Klassiska monocyter visar CCR2+Ly6ChögCX3CR1lågt uttryck, och icke-klassiska monocyter visar CCR2–Ly6ClågCX3CR1höga markörer5.
På grund av nödvändigheten av kvantitativ analys av marköruttryck, dvs. Ytterligare fördelar inkluderar identifiering av subpopulationer, förmågan att använda fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att sortera cellpopulationer för transkriptomisk eller proteomisk analys och ödesmappning. Den största nackdelen med multiparameter flöde cytometri är bristen på vävnad arkitektur. Detta kan övervinnas genom oftalmisk dissekering i de olika okulära underkommittéerna: hornhinna, bindhinnan, iris, linsen, näthinnan och choroid-sclera-komplexet. Dessutom kan bekräftande immunofluorescens imaging utföras, men begränsas av antalet markörer och brist på robust kvantifiering.
Genom breda associationsstudier har kopplat flera komplementgener till AMD16. Komplementaktivering leder till anafylatoxinproduktion, leukocytrekrytering och resulterande inflammation. Som komplement receptor bristfälliga möss, laser skada minskar mononuclear phagocyte rekrytering och laser-inducerad choroidal neovascularization (CNV) område17. På samma sätt visar C-C-motivet chemokinreceptor 2 (CCR2) knockoutmus, som har brist på monocytrekrytering till vävnaden, både minskad mononukleär fagocytrekrytering och laserinducerat CNV-område18. Dessa datalänk komplement och mononuclear phagocytes med experimentell CNV och eventuellt neovascular AMD. Till stöd för denna associering är komplementreceptorer dysregulerade på perifera blodmonocyter hos patienter med neovaskulär AMD19,20. Dessa data visar en stark koppling mellan AMD och mononuclear phagocytes.
I detta manuskript kommer vi att använda den experimentella laserinducerade CNV-modellen för att karakterisera de mononukleära fagocytpopulationerna i musögat med hjälp av multiparameterflödescytometri. Laser-inducerad CNV är standard mus modell av neovaskulär AMD, som visat effekten av nuvarande första raden neovaskulär AMD terapi21. Detta protokoll kommer att beskriva enucleation av mus ögon, okulär dissekering, matsmältningen i en enda cell suspension, antikropp färgning, bestämning av laser spänningar med hjälp av en färg kontroller och gating strategi med fluorescens minus en (FMO) kontroller. En detaljerad beskrivning av den laserinducerade CNV-modellen finns i en tidigare publikation22. Med hjälp av detta protokoll kommer vi att definiera mikroglia, monocyter, dendritiska celler och makrofagpopulationer. Dessutom kommer vi att använda MHCII och CD11c för att ytterligare definiera makrofagunderenheter inom laserinducerad CNV-modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multiparameterflödescytometri möjliggör kvantitativ analys av flera celltyper i en komplex vävnad. I denna rapport beskriver vi flöde cytometric detektion av mononuclear phagocyte populationer, inklusive monocyter, dendritiska celler och makrofag delmängder, efter laser skada i mus ögat. Liyanage et al rapporterade nyligen en liknande gating strategi för att upptäcka neutrofiler, eosinofiler, lymfocyter, DCs, makrofager, infiltrera makrofager och monocyter27. Vår gating strategi skiljer …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JAL fick stöd av NIH-bidraget K08EY030923; CMC stöddes av ett K01-anslag (5K01AR060169) från NIH National Institute of Arthritis and Musculoskeletal Diseases och ett nytt forskningsbidrag (637405) från Lupus Research Alliance.
Materials
| 0.6 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Costar | 3620 | |
| 10 ml pipettes | Fisher Scientific | 431031 | |
| 15 ml conicals | ThermoFisher | 339650 | |
| 1x HBSS, 500 ml | Gibco | 14025-092 | |
| 2.5 ml syringe | Henke Sass Wolf | 7886-1 | |
| 20% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| 25 ml pipettes | Fisher Scientific | 431032 | |
| 30 G needle | Exel | 26437 | |
| 3ml luer lock syringe | Fisher Scientific | 14955457 | |
| 41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish | Fisher Scientific | 08-732-112 | |
| 50 ml conicals | Falcon | 352070 | |
| 96-well, U-bottom assay plate without lid | Falcon | 353910 | |
| Amine reactive beads | ThermoFisher | A10628 | |
| Analysis software | FlowJo | v 10 | |
| Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set | BD Biosciences | 552845 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | |
| Cell counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell counter slides | Invitrogen | C10283 | |
| Compensation beads | ThermoFisher | 01-1111-42 | |
| Count beads | ThermoFisher | 01-1234-42 | |
| Curved forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | |
| Digestion enzyme | Sigma Aldrich | 5401020001 | |
| Dissecting microscope | National Optical and Scientific Instruments, Inc. | DC3-420T | |
| Dissociation tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| DNase | Roche | 10104159001 | |
| Electronic dissociator | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | ||
| Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fine forceps | Integra Miltex | 17035X | |
| Flow buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Flow tubes | Falcon | 352008 | |
| Hamster anti-mouse CD11c BV421 | BD Biosciences | 562782 | |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-123 | |
| Live/Dead dye | ThermoFisher | 65-0866-14 | |
| Lysing solution, 10x solution | BD Biosciences | 555899 | |
| Micro titer tube and rack | Fisher Scientific | 02-681-380 | |
| Mouse anti-mouse CD64 PE | BioLegend | 139304 | |
| Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594 | BD Biosciences | 562864 | |
| P1000 pipet tips | Denville Scientific | P2404 | |
| P1000 pipettor | Gilson | FA10006M | |
| P2 pipet tips | eppendorf | 22491806 | |
| P2 pipettor | Gilson | FA10001M | |
| P20 pipettor | Gilson | FA10003M | |
| P200 pipet tips | Denville Scientific | P2401 | |
| P200 pipettor | Gilson | FA10005M | |
| Pipet man | Fisher Scientific | FB14955202 | |
| Rat anti-mouse B220 PECF594 | BD Biosciences | 562313 | |
| Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7 | BD Biosciences | 557657 | |
| Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700 | BD Biosciences | 557958 | |
| Rat anti-mouse CD19 PE | BD Biosciences | 553786 | |
| Rat anti-mouse CD4 PECF594 | BD Biosciences | 562314 | |
| Rat anti-mouse CD45 FITC | ThermoFisher | 11-0451-82 | |
| Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552848 | |
| Rat anti-mouse CD8 PECF594 | BD Biosciences | 562315 | |
| Rat anti-mouse Ly6C | BD Biosciences | 561085 | |
| Rat anti-mouse Ly6G PECF594 | BD Biosciences | 562700 | |
| Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700 | BioLegend | 107622 | |
| Rat anti-mouse Siglec F PECF594 | BD Biosciences | 562757 | |
| Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647 | BD Biosciences | 564178 | |
| Shaking incubator | Labnet | 311DS | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile water, 500 ml | Gibco | A12873-01 | |
| Swinging bucket centrifuge | eppendorf | 5910 R | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Gibco | 15250061 |
References
- Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
- Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
- O’Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
- Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
- Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).
- Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
- Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099 (2019).
- Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).
- Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
- Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).
- Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636 (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
- Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
- Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
- Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
- Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
- Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).
- Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
- Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
