אפיון תאי מערכת החיסון ומתווכים פרו-דלקתיים בסביבה הריאתית
Summary
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בציטומטריה של זרימה כדי לזהות את השינויים בהרכב תאי מערכת החיסון, בפרופיל הציטוקינים ובפרופיל הכימוקין בסביבה הריאתית לאחר חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי, מודל מוריני של שבץ איסכמי.
Abstract
התרחבות תאי מערכת החיסון, הפעלתם וסחרם לריאות, הנשלטים על ידי ביטוי של ציטוקינים וכמוקינים מרובים, עשויים להשתנות על-ידי פגיעה מוחית חמורה. עדות לכך היא העובדה כי דלקת ריאות היא הגורם העיקרי לתמותה בחולים שסבלו משבץ איסכמי. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את השימוש באנליזה ציטומטרית של זרימה צבעונית כדי לזהות 13 סוגים של תאי חיסון בריאות של עכברים, כולל מקרופאגים אלוואולריים, מקרופאגים אינטרסטיציאליים, תאים דנדריטיים CD103+ או CD11b+ (DCs), פלסמציטואיד DCs, אאוזינופילים, מונוציטים / תאים שמקורם במונוציטים, נויטרופילים, תאי T ו- B שמקורם בלימפואידים, תאי NK ותאי NKT, בעקבות אינדוקציה של שבץ איסכמי על ידי חסימת עורק מוחי אמצעי חולף. יתר על כן, אנו מתארים את ההכנה של הומוגנטים ריאה באמצעות שיטת הומוגניזציה של חרוזים, כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים שונים או כימוקינים בו זמנית על ידי מערכי חרוזים מרובים יחד עם ניתוח ציטומטרי זרימה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לחקור את התגובה החיסונית הריאתית במסגרות מחלה אחרות, כגון מחלת ריאות זיהומית או מחלה אלרגית.
Introduction
הריאות הן איבר מחסום, חשוף לסביבה החיצונית, ולכן הם מקבלים כל הזמן אתגרים אימונולוגיים כגון פתוגנים ואלרגנים1. הפעלת תאי חיסון תושבי ריאה וחדירת תאי חיסון מהפריפריה נדרשים כדי לנקות פתוגנים מהסביבה הריאתית. בנוסף, תאי מערכת החיסון המתגוררים בריאות שומרים על סבילות לחיידקים קומנסליים, מה שמרמז על כך שתאים אלה ממלאים תפקיד בסילוק פתוגנים ובשמירה על הומאוסטזיס1. מקרופאגים אלוואולריים ואינטרסטיציאליים הם בין תאי מערכת החיסון הזקיף המתגוררים בריאה החשים פתוגנים באמצעות קולטני זיהוי תבניות ומנקים פתוגנים אלה על ידי פאגוציטוזה2. תאים דנדריטיים תושבי ריאות מגשרים על התגובה החיסונית המולדת והנרכשת באמצעות הצגת אנטיגן3. בנוסף, תאי מערכת החיסון המולדת המקומית המופעלים מייצרים ציטוקינים וכימוקינים המגבירים את התגובה הדלקתית ומעוררים את חדירתם של תאי מערכת החיסון כגון מונוציטים, נויטרופילים ולימפוציטים לריאות1. שבץ איסכמי הוכח כמשנה חסינות מערכתית ומוביל לרגישות מוגברת לזיהום ריאתי; עם זאת, מחקרים מעטים העריכו את התא הריאתי לאחר שבץ איסכמי, אם כי כמה מחקרים בחנו אותו במהלך מצבים דלקתיים 4,5,6,7,8,9. מטרת השיטות המתוארות כאן היא לקבוע בו זמנית את הפתולוגיה של הריאות, את הרכב תאי החיסון ואת רמות הביטוי של ציטוקינים וכימוקינים בריאות כדי להעריך שינויים בתא הריאתי ולהעריך שינויים פוטנציאליים בתגובה החיסונית הריאתית בעקבות התקף איסכמי.
המתואר כאן הוא פרוטוקול לקבלת תרחיפים של תאים בודדים מהריאות של העכברים כדי לזהות 13 סוגים של תאים חיסוניים. פרוטוקול זה מבוסס על עיכול רקמות עם קולגן D ללא צורך בדיסוציאציה אוטומטית של רקמות. בנוסף, פיתחנו פרוטוקול להכנת הומוגנטים של רקמות שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את רמות הביטוי של 13 ציטוקינים או כימוקינים שונים באמצעות מערכי חרוזי מולטיפלקס מבוססי ציטומטריה זורמת. פרוטוקול זה שימש בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות של שבץ איסכמי על חסינות ריאתית וניתן להשתמש בו גם במודלים אחרים של מחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים זיהוי של סוגי תאי חיסון הריאה וביטוי של כימוקינים או ציטוקינים באותו עכבר. אם רוצים מחקר היסטופתולוגיה, ניתן להסיר אונה בודדת ולתקן אותה למטרה זו לפני שממשיכים לשלבי הבידוד של התא הבודד. מגבלה אחת של שיטה זו היא שגישה זו עשויה שלא להתאים במסגרות מחלה מסוימ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH P20 GM109098 ותוכנית פרס החדשנות מפראספרו לאדווין וואן. ניסויי ציטומטריה של זרימה בוצעו במתקן ציטומטריה של זרימה WVU ומתקן ליבה של תא יחיד, הנתמך על ידי מענקי NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 ו- P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
