Характеристика иммунных клеток и провоспалительных медиаторов в легочной среде
Summary
Этот протокол описывает использование проточной цитометрии для выявления изменений в составе иммунных клеток, профиле цитокинов и хемокиновом профиле в легочной среде после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии, мышиной модели ишемического инсульта.
Abstract
Расширение, активация и перемещение иммунных клеток в легкие, которые контролируются экспрессией нескольких цитокинов и хемокинов, могут быть изменены тяжелой черепно-мозговой травмой. Об этом свидетельствует тот факт, что пневмония является основной причиной смертности у пациентов, перенесших ишемический инсульт. Целью этого протокола является описание использования многоцветного проточного цитометрического анализа для идентификации 13 типов иммунных клеток в легких мышей, включая альвеолярные макрофаги, интерстициальные макрофаги, дендритные клетки CD103+ или CD11b+ (DC), плазмацитоидные ДК, эозинофилы, моноциты / клетки, полученные из моноцитов, нейтрофилы, лимфоидные Т- и В-клетки, NK-клетки и клетки NKT, после индукции ишемического инсульта путем транзиторной окклюзии средней мозговой артерии. Кроме того, описано получение гомогенатов легких методом гомогенизации шариков для определения уровней экспрессии 13 различных цитокинов или хемокинов одновременно с помощью мультиплексных шариковых массивов в сочетании с проточным цитометрическим анализом. Этот протокол также может быть использован для исследования легочного иммунного ответа в других условиях заболевания, таких как инфекционное заболевание легких или аллергическое заболевание.
Introduction
Легкие являются барьерным органом, подвергаются воздействию внешней среды и, следовательно, постоянно получают иммунологические проблемы, такие как патогены и аллергены1. Активация легочно-резидентных иммунных клеток и инфильтрация иммунных клеток с периферии необходимы для очистки патогенов из легочной среды. Кроме того, иммунные клетки-резиденты легких поддерживают толерантность к комменсальным бактериям, предполагая, что эти клетки играют роль в клиренсе патогенов и поддержании гомеостаза1. Альвеолярные и интерстициальные макрофаги входят в число легочных дозорных иммунных клеток, которые воспринимают патогены через рецепторы распознавания образов и очищают эти патогены фагоцитозом2. Легочно-резидентные дендритные клетки соединяют врожденный и адаптивный иммунный ответ через презентацию антигена3. Кроме того, активированные местные врожденные иммунные клетки продуцируют цитокины и хемокины, которые усиливают воспалительную реакцию и стимулируют инфильтрацию иммунных клеток, таких как моноциты, нейтрофилы и лимфоциты, в легкие1. Было показано, что ишемический инсульт модифицирует системный иммунитет и приводит к повышенной восприимчивости к легочной инфекции; тем не менее, немногие исследования оценивали легочный компартмент после ишемического инсульта, хотя некоторые исследования изучали его во время воспалительных состояний 4,5,6,7,8,9. Целью способов, описанных в настоящем описании, является одновременное определение патологии легких, состава иммунных клеток и уровней экспрессии цитокинов и хемокинов в легких для оценки изменений в легочном компартменте и оценки потенциальных изменений легочного иммунного ответа после ишемической атаки.
Здесь описан протокол получения одноклеточных суспензий из легких мышей для идентификации 13 типов иммунных клеток. Этот протокол основан на переваривании тканей коллагеназой D без необходимости автоматизированного тканевого диссоциатора. Кроме того, мы разработали протокол для получения тканевых гомогенатов, которые можно использовать для определения уровней экспрессии 13 различных цитокинов или хемокинов с использованием мультиплексных шариковых массивов на основе проточной цитометрии. Этот протокол был успешно использован для исследования влияния ишемического инсульта на легочный иммунитет и может быть использован и в других моделях заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные здесь, позволяют идентифицировать типы иммунных клеток легких и экспрессию хемокинов или цитокинов у одной и той же мыши. Если требуется исследование гистопатологии, индивидуальная доля может быть удалена и зафиксирована для этой цели, прежде чем перейти к этапам …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом NIH P20 GM109098 и Программой премии за инновации от Пресперо до Эдвина Вана. Эксперименты по проточной цитометрии были проведены в WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, который поддерживается грантами NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 и P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
