Karakterisering van immuuncellen en pro-inflammatoire mediatoren in de pulmonale omgeving
Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van flowcytometrie om de veranderingen in de samenstelling van immuuncellen, het cytokineprofiel en het chemokineprofiel in de pulmonale omgeving te identificeren na voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader, een muizenmodel van ischemische beroerte.
Abstract
Immuuncelexpansie, activering en handel naar de longen, die worden gecontroleerd door de expressie van meerdere cytokines en chemokines, kunnen worden veranderd door ernstig hersenletsel. Dit blijkt uit het feit dat longontsteking een belangrijke doodsoorzaak is bij patiënten die hebben geleden aan ischemische beroerte. Het doel van dit protocol is om het gebruik van multicolor flowcytometrische analyse te beschrijven om 13 soorten immuuncellen in de longen van muizen te identificeren, waaronder alveolaire macrofagen, interstitiële macrofagen, CD103 + of CD11b + dendritische cellen (DC’s), plasmacytoïde DC’s, eosinofielen, monocyten / monocyten-afgeleide cellen, neutrofielen, lymfoïde afgeleide T- en B-cellen, NK-cellen en NKT-cellen, na ischemische beroerte-inductie door voorbijgaande midden cerebrale arterie occlusie. Bovendien beschrijven we de bereiding van longhomogenaten met behulp van een kraalhomogenisatiemethode, om de expressieniveaus van 13 verschillende cytokines of chemokines tegelijkertijd te bepalen door multiplex kralenarrays in combinatie met flowcytometrische analyse. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de pulmonale immuunrespons in andere ziekte-instellingen te onderzoeken, zoals infectieuze longziekte of allergische ziekte.
Introduction
De longen zijn een barrièreorgaan, blootgesteld aan de externe omgeving en worden daarom voortdurend geconfronteerd met immunologische uitdagingen zoals pathogenen en allergenen1. De activering van long-residente immuuncellen en de infiltratie van immuuncellen uit de periferie zijn nodig om pathogenen uit de pulmonale omgeving te verwijderen. Bovendien behouden long-residente immuuncellen tolerantie voor commensale bacteriën, wat suggereert dat deze cellen een rol spelen bij de klaring van pathogenen en het handhaven van homeostase1. Alveolaire en interstitiële macrofagen behoren tot de long-residente schildwachtcellen die pathogenen detecteren via patroonherkenningsreceptoren en deze pathogenen verwijderen door fagocytose2. Long-residente dendritische cellen overbruggen de aangeboren en adaptieve immuunrespons door middel van antigeenpresentatie3. Bovendien produceren geactiveerde lokale aangeboren immuuncellen cytokines en chemokines die de ontstekingsreactie versterken en de infiltratie van immuuncellen zoals monocyten, neutrofielen en lymfocyten in de longen stimuleren1. Van ischemische beroerte is aangetoond dat het de systemische immuniteit wijzigt en leidt tot een verhoogde gevoeligheid voor longinfectie; weinig studies hebben echter het pulmonale compartiment geëvalueerd na ischemische beroerte, hoewel sommige studies het hebben onderzocht tijdens ontstekingsaandoeningen 4,5,6,7,8,9. Het doel van de hierin beschreven methoden is om tegelijkertijd de longpathologie, de samenstelling van immuuncellen en de niveaus van cytokine- en chemokine-expressie in de longen te bepalen om veranderingen in het pulmonale compartiment te evalueren en mogelijke veranderingen in de pulmonale immuunrespons na ischemische aanval te beoordelen.
Hier beschreven is een protocol voor het verkrijgen van eencellige suspensies uit de longen van de muizen om 13 soorten immuuncellen te identificeren. Dit protocol is gebaseerd op weefselvertering met collagenase D zonder de noodzaak van een geautomatiseerde weefseldissociator. Daarnaast hebben we een protocol ontwikkeld om weefselhomogenaten te bereiden die kunnen worden gebruikt om de expressieniveaus van 13 verschillende cytokines of chemokines te bepalen met behulp van op flowcytometrie gebaseerde multiplex kralenarrays. Dit protocol werd met succes gebruikt om de effecten van ischemische beroerte op pulmonale immuniteit te onderzoeken en kan ook in andere ziektemodellen worden gebruikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven protocollen maken de identificatie van longimmuunceltypen en de expressie van chemokines of cytokines in dezelfde muis mogelijk. Als een histopathologisch onderzoek gewenst is, kan een individuele kwab voor dat doel worden verwijderd en gefixeerd voordat wordt overgegaan tot de isolatiestappen van één cel. Een beperking van deze methode is dat deze aanpak mogelijk niet geschikt is in sommige ziekteomgevingen als de verandering in de samenstelling van de immuuncellen en de expressie van chemokines en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie P20 GM109098 en het Innovation Award-programma van Praespero tot Edwin Wan. Flow Cytometry experimenten werden uitgevoerd in de WVU Flow Cytometry &Single Cell Core Facility, die wordt ondersteund door NIH-subsidies S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 en P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
References
- Lloyd, C. M., Marsland, B. J. Lung Homeostasis: Influence of Age, Microbes, and the Immune System. Immunity. 46 (4), 549-561 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hartl, D., et al. Innate Immunity of the Lung: From Basic Mechanisms to Translational Medicine. Journal of Innate Immunity. 10 (5-6), 487-501 (2018).
- Prass, K., et al. Stroke-induced immunodeficiency promotes spontaneous bacterial infections and is mediated by sympathetic activation reversal by poststroke T helper cell type 1-like immunostimulation. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 725-736 (2003).
- Smith, C. J., et al. Interleukin-1 receptor antagonist reverses stroke-associated peripheral immune suppression. Cytokine. 58 (3), 384-389 (2012).
- McCulloch, L., Smith, C. J., McColl, B. W. Adrenergic-mediated loss of splenic marginal zone B cells contributes to infection susceptibility after stroke. Nature Communications. 8 (1), 15051 (2017).
- Dames, C., et al. Immunomodulatory treatment with systemic GM-CSF augments pulmonary immune responses and improves neurological outcome after experimental stroke. Journal of Neuroimmunology. 321, 144-149 (2018).
- Jin, R., Liu, S., Wang, M., Zhong, W., Li, G. Inhibition of CD147 Attenuates Stroke-Associated Pneumonia Through Modulating Lung Immune Response in Mice. Frontiers in Neurology. 10, 853 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments. (69), e4038 (2012).
- Farris, B. Y., et al. Ischemic stroke alters immune cell niche and chemokine profile in mice independent of spontaneous bacterial infection. Immunity, Inflammation and Diseases. 7 (4), 326-341 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. Journal of Visualized Experiments. (129), e56440 (2017).
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
- Monaghan, K. L., Zheng, W., Hu, G., Wan, E. C. K. Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).
- Zhai, X., et al. A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells. Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).
- Platzer, B., et al. Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites. Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).
- Shinoda, K., et al. Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).
- Nakahashi-Oda, C., et al. Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces. Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).
- Barrott, J. J., et al. Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3′-lipid signaling and inflammation. Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).
- Bouté, M., et al. The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection. Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).
- Bal, S. M., et al. IL-1β, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs. Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).
- Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).
