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Immunology and Infection

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस में विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए लाइव-सेल फॉरवर्ड जेनेटिक दृष्टिकोण

Published: June 10, 2020 doi: 10.3791/61365
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Idaho

Summary

यह प्रोटोकॉल क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिसके विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए एक निर्देशित आगे आनुवंशिक दृष्टिकोण में फ्लोरोसेंट प्रमोटर-रिपोर्टर्स, लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी, और व्यक्तिगत समावेशन निष्कर्षण का उपयोग करता है।

Abstract

इंट्रासेलुलर बैक्टीरियल रोगजनक क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस एक विकासात्मक चक्र से गुजरता है जिसमें दो रूपात्मक रूप से असतत विकासीय रूप होते हैं। गैर-प्रतिकृति प्राथमिक शरीर (ईबी) मेजबान के संक्रमण की शुरुआत करता है। एक बार अंदर, ईबी जालीदार शरीर (आरबी) में अंतर करता है। आरबी तो प्रतिकृति के कई दौर से गुजरता है, संक्रामक ईबी फार्म में वापस अंतर से पहले । यह चक्र क्लैमिडियल अस्तित्व के लिए आवश्यक है क्योंकि सेल प्रकारों के बीच स्विच करने में विफलता मेजबान आक्रमण या प्रतिकृति को रोकती है।

क्लैमाइडिया की अनिवार्य इंट्रासेलुलर प्रकृति के कारण आनुवंशिक तकनीकों में सीमाएं कोशिका-प्रकार के विकास में शामिल आणविक तंत्र की पहचान में बाधा उत्पन्न हुई हैं। हमने एक उपन्यास ड्यूल प्रमोटर-रिपोर्टर प्लाज्मिड सिस्टम तैयार किया है, जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर, वास्तविक समय में सेल प्रकार स्विचिंग के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सेल-प्रकार के विकास के नियमन में शामिल जीन की पहचान करने के लिए, लाइव-सेल प्रमोटर-रिपोर्टर प्रणाली को दोहरे रिपोर्टर स्ट्रेन के रासायनिक म्यूटेनेसिस, इमेजिंग और क्लैमाइडिया की ट्रैकिंग को बदल विकासात्मक काइनेटिक्स के साथ जोड़कर एक फॉरवर्ड जेनेटिक दृष्टिकोण के विकास के लिए लीवरेज किया गया था, जिसके बाद म्यूटेंट के क्लोनल अलगाव थे । यह आगे आनुवंशिक कार्यप्रवाह एक लचीला उपकरण है कि आनुवंशिक रास्तों की एक विस्तृत श्रृंखला में निर्देशित पूछताछ के लिए संशोधित किया जा सकता है ।

Introduction

क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस (सीटीआर) एक अनिवार्य इंट्रासेलुलर रोगजनक है जो एक बिफेसिक विकासात्मक चक्र के माध्यम से प्रगति करता है जो इसके अस्तित्व और प्रसार के लिए आवश्यक है1। इस चक्र में दो विकासात्मक रूप होते हैं, प्राथमिक निकाय (ईबी) और रेटिकलेट बॉडी (आरबी)। ईबी अक्षम है लेकिन प्रभावक प्रेरित एंडोसाइटोसिस2के माध्यम से सेल आक्रमण को मध्यस्थता करता है । एक बार मेजबान में, ईबी प्रतिकृति आरबी के लिए परिपक्व होता है। आरबी संक्रमण के बाद के दौर शुरू करने के लिए ईबी में वापस बदलने से पहले प्रतिकृति के कई दौर किया जाता है ।

आनुवंशिक उपकरणों की सीमित सरणी जैव रासायनिक अध्ययन या सरोगेट सिस्टम के उपयोग के लिए क्लैमिडियल अनुसंधान के अधिकांश प्रतिबंधित है । परिणामस्वरूप, विकास चक्र के जीन विनियमन और नियंत्रण की स्पष्टता कठिन रही है3,,4. क्लैमिडियल क्षेत्र में अधिक महत्वपूर्ण चुनौतियों में से एक क्लैमिडियल विकासात्मक चक्र की उच्च संकल्प लौकिक ट्रैकिंग और इसके नियमन में शामिल प्रोटीन की पहचान है । क्लैमिडियल विकास चक्र के दौरान जीन अभिव्यक्ति पारंपरिक रूप से विनाशकारी "एंड पॉइंट" तरीकों द्वारा की गई है जिसमें आरएनएक्यू, क्यूपीसीआर और फिक्स्ड सेल माइक्रोस्कोपी5,,6शामिल हैं। यद्यपि इन तरीकों ने अमूल्य जानकारी प्रदान की है, नियोजित तकनीकें श्रमसाध्य हैं और कम लौकिक संकल्प5,,6हैं।

पिछले दशक के भीतर, सीटीआर के आनुवंशिक हेरफेर ने प्लाज्मिड परिवर्तन और,म्यूटेनेसिस7,8,9के लिए विधियों की शुरुआत के साथ प्रगति की है।, इस अध्ययन के लिए, संक्रमण के दौरान वास्तविक समय में व्यक्तिगत समावेशन में क्लैमिडियल विकास की निगरानी के लिए एक प्लाज्मिड-आधारित प्रणाली विकसित की गई थी। एक क्लैमिडियल ट्रांसफॉर्मेंट बनाया गया था जिसने आरबी और ईबी सेल-टाइप विशिष्ट प्रमोटर-रिपोर्टर दोनों को व्यक्त किया था। आरबी विशिष्ट रिपोर्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन क्लोवर के प्रारंभिक आरबी जीन यूओ अपस्ट्रीम के प्रमोटर को फ्यूज करके बनाया गया था । यूईओ एक प्रतिलेखन नियामक है जो देर से ईबी संबद्ध जीन10के सबसेट का दमन करता है । एचसीटीबीके प्रमोटर, जो ईबी न्यूक्लियॉइड संघनन में शामिल एक हिस्टोन जैसे प्रोटीन को एन्कोड करते हैं, को ईबी विशिष्ट रिपोर्टर11बनाने के लिए सीधे mKate2 (RFP) के ऊपर क्लोन किया गया था । एचसीटीबीप्रोम-एमकेटे2/यूओ प्रोम-क्लोवर के लिए रीढ़ p2TK2SW27था ।euo एचसीटीबी और यूओ प्रमोटरों को सीटीआर-एल2 जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित किया गया था । प्रत्येक प्रमोटर अनुक्रम में निर्दिष्ट क्लैमिडियल जीन के लिए अनुमानित ट्रांसक्रिप्शन स्टार्ट साइट के ~ 100 बेस जोड़े शामिल थे और संबंधित ओआरएफ के पहले 30 न्यूक्लियोटाइड (10 अमीनो एसिड) थे। फ्लोरोसेंट एफपी वेरिएंट को व्यावसायिक रूप से सीटीआर कोडन अनुकूलित जीन ब्लॉक के रूप में प्राप्त किया गया था और प्रत्येक क्लैमिडियल जीन और प्रमोटर के पहले 30 न्यूक्लियोटाइड के साथ फ्रेम में क्लोन किया गया था। आईएनसीडी टर्मिनेटर को सीधे mKate2 के डाउनस्ट्रीम क्लोन किया गया था। दूसरा प्रमोटर-रिपोर्टर को आईएनसीडी टर्मिनेटर के डाउनस्ट्रीम डाला गया । p2TK2SW2 में एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन(बला)को pBam4 से aadA जीन (स्पेक्टिनोमाइसिन प्रतिरोध) के साथ प्रतिस्थापित किया गया था। इसके परिणामस्वरूप अंतिम निर्माण p2TK2-hctB प्रोम-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर(चित्रा 1A)है कि Ctr-L27में तब्दील हो गया था ।hctBeuo इस आरबी/ईबी रिपोर्टर तनाव लाइव सेल माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1बी, सी)का उपयोग कर एकल समावेशन के भीतर विकास चक्र के अवलोकन के लिए अनुमति दी ।

रासायनिक म्यूटागेनिसिस के संयोजन में हमारे प्रमोटर-रिपोर्टर निर्माण को नियोजित करना, एक प्रोटोकॉल को ट्रैक करने और अलग करने के लिए तैयार किया गया था जो सीटीआर सेवर एल 2 की म्यूटेजेनाइज्ड आबादी से विकासात्मक असामान्यताओं को प्रदर्शित करता था। यह प्रोटोकॉल व्यक्तिगत क्लैमिडियल समावेशन की सीधी निगरानी, समय के साथ जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल की ट्रैकिंग, क्लैमिडियल क्लोन की पहचान करने की अनुमति देता है जो एक परिवर्तित विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को व्यक्त करते हैं, और व्यक्तिगत समावेशन से क्लैमाइडिया के क्लोनल अलगाव।

हालांकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से क्लैमिडियल विकास में शामिल जीन की पहचान के लिए बनाया गया है, लेकिन क्लैमिडियल आनुवंशिक मार्गों की किसी भी संख्या से पूछताछ करने के लिए इसे आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी पायथन स्क्रिप्ट गिथब https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing पर उपलब्ध हैं

1. Mutagenize रिपोर्टर क्लैमाइडिया

नोट: Ctr-L2-hctB प्रोम-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर ईबी सीधे एक्सनिक मीडिया सीआईपी-1 में एथिल मीथेनसुल्फोनेट (ईएमएस) का उपयोग कर के रूप में इस मीडिया ईबी चयापचय और ईबी संक्रमितता12के रखरखाव का समर्थन करता है ।hctBeuo

  1. ~3 x 107 ईबी युक्त बर्फ पर एक क्लैमाइडियल स्टॉक को पी2TK2-एचसीटीबी प्रोम-एमकेटे2/यूओ प्रोम-क्लोवर रिपोर्टर प्लाज्मिड और पैलेट पर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बदल दिया गया ।hctBeuo
    नोट: इन प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले क्लैमाइडिया जीव 1x सुक्रोज-फॉस्फेट-ग्लूटामेट बफर (एसपीजी) में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए 30% रेनोग्रैफिन घनत्व शुद्ध और जमे हुए थे।
  2. सुपरनेट को त्यागें और सीआईपी-1 बफर के 100 माइक्रोल में ईबी पेलेट को 10 एस के लिए 10% बिजली पर बर्फ पर सोनीशिक के साथ फिर से व्यतीत करें। म्यूटेजेनाइज्ड और मॉक ट्रीट किए गए नमूनों के लिए ईबी निलंबन के 100 माइक्रोन को दो 50 माइक्रोन एलिकोट में विभाजित करें।
  3. ईएमएस-सीआईपी-1 समाधान के 20 मिलीग्राम/एमएल को अलग-अलग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में तैयार करें। ऐसा करने के लिए, 375 माइक्रोन कुल मात्रा में ईएमएस के 6.8 माइक्रोन जोड़ें।
  4. म्यूटेनेसिस के लिए क्लैमिडियल एलिकोट्स में से एक में ईएमएस-सीआईपी-1 समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें और सीआईपी-1 के 50 माइक्रोन केवल नकली म्यूटेनेसिस के लिए अन्य क्लैमाइडियल एलिकोट में जोड़ें।
    नोट: अंतिम ईएमएस एकाग्रता 10 मिलीग्राम/एमएल है । क्लैमाइडियल टाइटर, ईएमएस एकाग्रता, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एक्सपोजर के समय संक्रामक संतान में लगभग 60-80% की कमी का कारण बनते हैं। कमी का यह स्तर क्लैमिडियल जीनोम8प्रति ~ 5-20 डीएनए घावों से मेल खाता है।
  5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट। म्यूटेनेनाइज्ड ईबी का इस्तेमाल सेक्शन 2 में मोनोलेयर्स को संक्रमित करने के लिए सीधे किया जाएगा ।
    सावधानी: ईएमएस एक ज्ञात कैंसरकारक है। ईएमएस के संपर्क में आने वाले सभी उपकरणों और सामग्रियों को निपटान से पहले 24 घंटे के लिए 1 एम नाओएच में भिगोया जाना चाहिए, ईएमएस सामग्री के प्रोटोकॉल और सफाई के दौरान हर समय दस्ताने का उपयोग किया जाना चाहिए।

2. उत्परिवर्ती सीटीआर की इमेजिंग

  1. इमेजिंग और म्यूटेजेनाइज्ड सीटीआर के अलगाव के लिए होस्ट सेल संस्कृति
    1. बीज एक 6 अच्छी तरह से ग्लास नीचे प्लेट के साथ 6 x 105 Cos-7 कोशिकाओं (एटीसीसी) प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीएल में पूरा मीडिया (RPMI-१६४० 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 10 मिलीग्राम/एमएल gentamicin के साथ पूरक) । म्यूटेजेनाइज्ड सीटीआर की इमेजिंग के लिए इस ग्लास बॉटम प्लेट का इस्तेमाल करें।
    2. 1 एमएल पूर्ण मीडिया में 1 x 105 Cos-7 कोशिकाओं (एटीसीसी) प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से पॉलीस्टीरिन प्लेट बीज। ब्याज के अलग क्लैमाइडिया के पुनर्निर्धन के लिए इस पॉलीस्टीरिन प्लेट का उपयोग करें।
    3. लगभग 18 घंटे के लिए 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों प्लेटों को इनक्यूबेट करें। एक बार कोशिकाओं को संकुचित पहुंचने, पूर्ण मीडिया के साथ मीडिया की जगह 1 μg के साथ पूरक/
  2. म्यूटेजनाइज्ड सीटीआर के साथ मेजबान सेल संस्कृति को संक्रमित करना
    1. 1.5 एमएल/अच्छी तरह से बर्फ ठंडे एचबीएस में म्यूटेजेनाइज्ड ईबीएस के ~ 6 x 105 के साथ ग्लास बॉटम प्लेट के 5 कुओं को संक्रमित करें । इसके परिणामस्वरूप ~ 0.3 का एमओआई होगा क्योंकि म्यूटेनेसिस के कारण ~ 70% मृत्यु दर की उम्मीद है।
    2. 1.5 एमएल/अच्छी तरह से बर्फ ठंडे एचबीएस में ~ 2 x 105 नकली म्यूटेजेनाइज्ड ईबीएस के साथ शेष अच्छी तरह से संक्रमित करें। म्यूटेनेसिस के बिना, कम मृत्यु दर की उम्मीद करें, इस प्रकार एक तिहाई इनोकुलम का उपयोग ~ 0.3 के एमओआई को प्राप्त करने के लिए किया जाता है।
      नोट: ~ 0.3 का एमओआई यह सुनिश्चित करता है कि मेजबान कोशिकाएं एक ईबी से संक्रमित हैं और क्लोनल अलगाव के लिए संक्रमित कोशिकाओं के बीच पर्याप्त अलगाव की अनुमति देती हैं।
    3. 15 मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट, कमाल के साथ, ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    4. संक्रमित मेजबान कोशिकाओं को प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) एचबीएसएस के साथ धोएं जिसमें 1 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन होता है, जिसके तुरंत बाद एचबीबीएस कुल्ला होता है । हेपरिन वॉश दोहराएं, तुरंत एचबीएस के साथ 2x को कुल्ला करें ताकि हेपरिन को हटाया जा सके।
      नोट: हेपरिन मेजबान सेल और ईबीएस13के बीच शुरुआती इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन को रोकता है और रिवर्स कर सकता है । हेपरिन वॉश उन ईबी को हटा देते हैं जो अभी तक मेजबान कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करते हैं, संक्रमण को सिंक्रोनाइज करते हैं। जब धोने की कोशिकाएं कोशिकाओं को कुओं की सतह से कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने से रोकने के लिए धीरे से ऐसा करती हैं । एचबीएसएस और हेपरिन समाधानों में अवशिष्ट ईएमएस होते हैं और निपटान से पहले 24 घंटे के लिए 1 एम नाओह युक्त बीकर में रखा जाना चाहिए।
    5. एचबीएसएस को प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) इमेजिंग मीडिया (पूर्ण मीडिया, 1 μg/mL cycloheximide, 20 mM HEPES, और कोई फिनॉल लाल) के साथ बदलें।
    6. तापमान नियंत्रण में सहायता करने और वाष्पीकरण को कम करने2के लिए प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ इंटरवेल रिक्त स्थान भरें। 10 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. माइक्रोस्कोप की स्थापना और इमेजिंग
    नोट: बहुरंगी मल्टीपोजिशन स्वचालित लाइव-सेल फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग क्लैमिडियल म्यूटेंट की पहचान करने के लिए समय-चूक छवियों को इकट्ठा करने के लिए किया जाता है जो विकासात्मक जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता में भिन्न होते हैं। यह प्रोटोकॉल स्वचालित माइक्रोस्कोप नियंत्रण के लिए ओपन सोर्स μManager सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करता है14.
    1. माइक्रोस्कोप सेटअप 10 एच पोस्ट संक्रमण शुरू करें। माइक्रोस्कोप स्टेज इनक्यूबेटर को 5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस सेट करें। संक्रमित 6 अच्छी तरह से ग्लास बॉटम प्लेट को स्टेज इनक्यूबेटर में रखें और सैंपल थर्मिस्टर को इंटरवेल एच2ओ में डालें।
    2. उच्च सामग्री स्क्रीनिंग(एचसीएस)प्लगइन का उपयोग करके XY चरण को कैलिब्रेट करें। प्लगइन्स पर क्लिक करें । अधिग्रहण उपकरण । μManager माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में एचसीएस साइट जनरेटर(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2)।
    3. 6-वेल प्लेट टेम्पलेट का चयन करें और एचसीएस प्लगइन(JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4)के भीतर 12 क्षेत्रों के दृश्य (एफओवी) से मिलकर एक इमेजिंग स्थिति सूची उत्पन्न करें। स्टेज पोजीशन लिस्ट खोलें और मैन्युअल रूप से फोकस करें और स्टेज कंट्रोल प्लगइन(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6)का उपयोग करके प्रत्येक एफओवी के लिए प्रारंभिक जेड स्थिति निर्धारित करें। किसी भी FOV के XY निर्देशांक को समायोजित करें जिसमें कोशिकाओं की याद आ रही है या एक समान मोनोलेयर नहीं है।
      नोट: प्रत्येक छवि को कैप्चर किए जाने में लगने वाले समय के कारण, प्रति 30 मिनट के अंतराल पर अधिकतम 72 एफओवी लिया जा सकता है।
    4. इमेजिंग के लिए 20x ऑब्जेक्टिव लेंस का इस्तेमाल करें। यह आवर्धन ~ 8 समावेशन को प्रति एफओवी इमेज करने की अनुमति देता है, जबकि अभी भी वांछित संकल्प प्रदान करता है।
    5. पदों की सूची को सहेजें क्योंकि इसका उपयोग डेटा विश्लेषण(JoVE61365_screenfile7)के बाद ब्याज के समावेशन का पता लगाने के लिए किया जाएगा।
    6. ऑटोमेटेड इमेजिंग(JoVE61365_screenfile8)के लिए फोकस सेट करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ऑटो फोकस ऑप्शन का इस्तेमाल करें ।
    7. μManager में छवि आधारित ऑटोफोकस का उपयोग करके सबसे सुसंगत फोकस परिणामों का उत्पादन करने के लिए निम्नलिखित चयन और मूल्यों का उपयोग करें। ऑटोफोकस गुणों में विंडो ड्रॉप-डाउन मेनू से OughtaFocus का चयन करें और निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें। OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-एक्सपोजर: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff (%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff (%): 14, OughtaFocus-showImages: हां, OughtaFocus-मैक्सिमम: शार्प्डगेस, OughtaFocus-चैनल: डीआईसी ।
      नोट: फसल कारक को कम करके ऑटोफोकस इमेजिंग विंडो को कम करना अधिक सुसंगत ऑटो फोकसिंग के लिए अनुमति देता है। OughtaFocus-ShowImages के लिए हां का चयन उपयोगकर्ता को ऑटोफोकस छवि देखने की अनुमति देता है।
    8. 30 मिनट के समय अंतराल(JoVE61365_screenfile9)के साथ 24 घंटे के लिए इमेजिंग द्वारा विकास चक्र के काइनेटिक्स पर कब्जा करें। 12-36 एचपीआई के बीच इमेजिंग यह सुनिश्चित करती है कि क्लैमाइडिया विकास चक्र को पूरा करता है लेकिन मेजबान सेल को नहीं आता है।
    9. छवि 250 एमएस एक्सपोजर के साथ सेल मोनोलेयर्स क्रमशः जीएफपी और आरएफपी चैनलों में 4% और 18% तीव्रता के साथ(JoVE61365_screenfile10)। 514/30 एनएम बैंडपास उत्सर्जन फिल्टर के साथ 470 एनएम पर उत्तेजन द्वारा क्लोवर (जीएफपी) सिग्नल का पता लगाएं। 595 एनएम पर उत्तेजन द्वारा और 641/75 एनएम बैंडपास उत्सर्जन फिल्टर के साथ mKate2 (RFP) संकेत का पता लगाएं।
      नोट: फ्लूरोफोर फोटोब्लाचिंग और फोटोटॉक्सिकिटी को क्लैमाइडियातक कम करने के लिए उत्तेजन तीव्रता को कम करना महत्वपूर्ण है। 200-300 एमएस एक्सपोजर के साथ एक हल की गई छवि उत्पन्न करने के लिए न्यूनतम उत्तेजन तीव्रता को पायलट अध्ययन में अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    10. फोकस की एक श्रृंखला के साथ कई जेड-स्लाइस कैप्चर करें जो इन-फोकस स्लाइस के दोनों तरफ समाप्त होता है। इस प्रयोग में, 20x आवर्धन पर, यह 10 माइक्रोन चरणों(JoVE61365_screenfile11)पर 4 स्लाइस के साथ हासिल किया गया था।
    11. अधिग्रहण विंडो में कई स्लाइस इमेजिंग के लिए सापेक्ष जेड का चयन करें। सापेक्ष जेड विकल्प अगली बार अंतराल के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में इमेजिंग स्थिति सूची में सहेजे गए जेड विमान स्थान का उपयोग करता है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग चैनलों(JoVE61365_screenfile12)के लिए उपयुक्त जेड-ऑफसेट मूल्यों को इनपुट करें।
      नोट: छवि आधारित फोकसिंग सिस्टम अपूर्ण है और 24 घंटे इमेजिंग अवधि में यह फोकस बहाव की ओर जाता है। यह पाया गया कि हर बार बिंदु के लिए 3-4 जेड फोकल विमानों पर कब्जा करके एक में ध्यान केंद्रित छवि बनाए रखा गया था । फ्लोरोसेंट इमेज चैनल्स और डीआईसी चैनल के बीच फोकल प्लेन में मतभेदों को सही करने के लिए जेड-ऑफसेट की जरूरत है । इस जेड-ऑफसेट के अनुभवजन्य निर्धारण की जरूरत होगी ।
    12. रूट निर्देशिका का चयन करके और प्रयोग का नामकरण करके छवियों को सहेजें। टिफ स्टैक फाइल्स (JoVE61365_screenfile13)के रूप में छवियों को सहेजने के लिए μManager छवि स्टैक फ़ाइल विकल्प का उपयोग करें।
    13. मल्टी-डी एक्विजिशन विंडो(JoVE61365_screenfile13)में अधिग्रहण कमेंट बॉक्स में प्रायोगिक विवरण रिकॉर्ड करें। यानी, अच्छी तरह से A1: अनुपचारित नियंत्रण। खैर A2-3 और B1-3: ईएमएस म्यूटेंट। इमेजिंग: 12-36HPI। 12 एचपीआई पर छवि अधिग्रहण शुरू करें।
      नोट: यदि μManager का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रयोग पूरा होने के बाद प्रोग्राम, प्रायोगिक सेटअप और माइक्रोस्कोप हार्डवेयर को चलाना छोड़ दें। इमेजिंग साइटों को शामिल करने के अलगाव के लिए फिर से गौर किया जाएगा एक बार उत्परिवर्तनीकृत आबादी का विश्लेषण पूरा हो गया है ।

3. बदल विकासात्मक फेनोटाइप के साथ म्यूटेग्नाइज्ड क्लैमाइडिया की पहचान और अलग करें

  1. एक इन-फोकस इमेज स्टैक बनाना
    1. सहेजे गए इमेज डेटा का उपयोग करके जेड-स्टैक से सबसे अधिक फोकस छवि निकालें जिसमें प्रति टाइम पॉइंट 4 जेड स्लाइस होते हैं। कुर्तासिस माप विकल्प का उपयोग करें(विश्लेषण । उपाय)ImageJ/FIJI में स्वचालित रूप से फोकस जेड स्लाइस (उच्चतम कर्टोसिस स्कोर) में सबसे अधिक पहचान करने के लिए और सिर्फ इन इन-फोकस छवियों के साथ एक नई छवि ढेर बनाएं। इस प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए एक पायथन स्क्रिप्ट को पूरक फ़ाइल(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)के रूप में शामिल किया गया है।
  2. व्यक्तिगत समावेशन में फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें
    नोट: दो संवाददाताओं की अभिव्यक्ति काइनेटिक्स की मात्रा निर्धारित करने के लिए ओपन सोर्स इमेज एनालिसिस एप्लीकेशन इमेजजे/फिजी और प्लगइन ट्रैकमेट15का उपयोग करें । ट्रैकमेट 'स्पॉट' (इस मामले में समावेशन के अनुरूप) की पहचान करता है और समय के साथ प्रत्येक समावेश(JoVE61365_screenfile14)के लिए एक्स, वाई स्थान और सिग्नल तीव्रता को रिकॉर्ड करने वाले समय-चूक छवि स्टैक के माध्यम से उनका अनुसरण करता है। यह जानकारी सीएसवी फ़ाइल के रूप में सहेजी जाती है और विश्लेषण के लिए एक कस्टम पायथन नोटबुक में आयात की जाएगी।
    1. प्लगइन्स पर क्लिक करके बायो-फॉर्मेट आयातक का उपयोग करके इमेजजे/फिजी में इन-फोकस जेड-कम इमेज स्टैक खोलें । जैव-प्रारूप । जैव प्रारूप आयातक। हाइपरस्टैक और कंपोजिट (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16) काचयन करें।
    2. प्रक्रिया पर क्लिक करके छवि पृष्ठभूमि घटाना । 50.0 पिक्सल के रोलिंग बॉल त्रिज्या का उपयोग करके बैकग्राउंड को घटाएं और संतृप्त पिक्सेल (प्रक्रिया) के लिए छवि के विपरीत को 0.3% तकबढ़ाएं। इसके विपरीत बढ़ाएं)। छवि मूल्यों को 10.0 से गुणाकरें ( प्रक्रिया। गणित । गुणा)(JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22)।
    3. ट्रैकमेट में(प्लगइन्स । ट्रैकिंग । ट्रैकमेट),48 पिक्सल के अनुमानित ब्लॉब व्यास का चयन करें (इमेजिंग के अंत में शामिल किए जाने के आकार के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित)। 8.0 पिक्सल की लिंकिंग अधिकतम दूरी और गैप-क्लोजिंग अधिकतम दूरी और 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25)के गैप-क्लोजिंग मैक्स फ्रेम गैप का चयन करके गैर-खंडित समावेश पटरियों का उत्पादन करें।
      नोट: पूरे चक्र में शामिल किए जाने वाले समावेशन की पहचान करने और ट्रैक करने की ट्रैक करने की ट्रैक करने की ट्रैक करने की ट्रैक करने के लिए एक अलग छवि चैनल यूओप्रोम और एचसीटीबीप्रोम चैनलों को एक साथ इमेजजे/फिजी में इमेज मैथ फ़ंक्शन का उपयोग करके बनाया गया है। इसके बाद इस चैनल का उपयोग ट्रैकमेट द्वारा समय के साथ समावेशन की पहचान करने और उनका पालन करने के लिए किया जाता है। यूओप्रोम और एचसीटीबीप्रोम चैनलों के फ्लोरोसेंट मूल्यों को फिर चैनलों 2 और 3 में दर्ज किया जाता है।
    4. रिकॉर्ड ट्रैक जो न्यूनतम निरंतर अवधि को पूरा करते हैं: ट्रैक की अवधि: 20(JoVE61365_screenfile26)। पटरियों का विश्लेषण करें और ट्रैक डेटा में स्पॉट को सीएसवी फ़ाइल(JoVE61365_screenfile27)के रूप में सहेजें।
      नोट: इस प्रक्रिया को एक कस्टम पायथन स्क्रिप्ट का उपयोग करके स्वचालित किया गया है जो पूरक डेटा(TrackMate_Zreduced_JOVE.py)में प्रदान किया जाता है।
  3. बदल विकास प्रोफाइल के साथ शामिल किए जाने वाले पटरियों की पहचान करें
    नोट: समावेशन युक्त की पहचान करने के लिए Chlamydia परिवर्तित विकासात्मक प्रोफाइल के साथ, प्रत्येक समावेश ट्रैक को पायथन नोटबुक का उपयोग करके कल्पना की गई थी। ये दृश्य गतिज जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ समावेशन की पहचान के लिए अनुमति देते हैं जो नकली-इलाज आबादी से भिन्न होते हैं। परिवर्तित विकासात्मक प्रोग्रामिंग के साथ समावेशन की पहचान के लिए उपयोग की जाने वाली पायथन नोटबुक पूरक डेटा में प्रदान की जाती है (EMS_Screen-मार्कडाउन).
    1. EMS_Screen-मार्कडाउन पायथन नोटबुक में आयात सेल का उपयोग करके पांडा डेटा फ्रेम में ट्रैक सांख्यिकी सीएसवी फाइलों में स्पॉट से शामिल किए गए ट्रैक डेटा का आयात करें ।
    2. बेसलाइन बेसलाइन घटाव कोशिकाओं का उपयोग करके प्रत्येक ट्रैक के न्यूनतम मूल्य को शेष ट्रैक मूल्यों से घटाकर प्रत्येक ट्रैक को सही करें। अचार सेल के रूप में सहेजें का उपयोग कर एक अचार फ़ाइल के रूप में जिसके परिणामस्वरूप मूल्यों को बचाओ । यह बाद में पुनर्प्राप्ति के लिए बेसलाइन घटाव के बाद चैनल मानों को स्थायी रूप से बचाएगा।
      नोट: बेसलाइन घटाव हर समावेश की शुरुआती फ्लोरोसेंट तीव्रता को शून्य पर सेट करता है।
    3. फिल्टर किनारों सेल का उपयोग करते हुए एफओवी के किनारों के पास समावेशन से निशान को हटा दें क्योंकि उनके फ्लोरोसेंट प्रोफाइल को पूरी तरह से कैप्चर नहीं किया जा सकता है; ये निशान झूठी सकारात्मक विकासात्मक प्रोफाइल का उत्पादन कर सकते हैं।
    4. प्रायोगिक प्रारंभ समय और इमेजिंग समय अंतराल का उपयोग करके समय-चूक अंशांकन सेल के साथ छवि स्लाइस से समय(स्टार्टटाइम, अंतराल)मूल्यों के फ्रेम(कुल सीमा)मूल्यों को कैलिब्रेट करें। ट्रैक अवधि फ़िल्टर सेल का उपयोग करके प्रयोग (16-36 एचपीआई) के अंतिम 20 घंटे से अधिक का विस्तार नहीं करने वाले निशान को फ़िल्टर करके आंशिक समावेश को बाहर निकालें।
    5. असाइन ट्रीटमेंट सेल के साथ प्रायोगिक स्थिति द्वारा अलग-अलग डेटा फ्रेम में अलग-अलग ट्रैक। समावेशन के लिए फ़िल्टर जो विकास सेल के लिए फ़िल्टर का उपयोग करके पर्याप्त विकास प्रदर्शित करते हैं। विकास सेल के लिए फिल्टर में, अनुभवजन्य कोड की अंतिम दो लाइनों के भीतर मूल्यों को बदलकर यूओप्रोम चैनल के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता सीमा निर्धारित की है । यह क्लैमाइडिया को फ़िल्टर करेगा जो विकसित नहीं हुआ था।
      नोट: थ्रेसहोल्ड फ़िल्टर सेट करते समय सतर्क रहें, यदि फ़िल्टर बहुत कम है तो परिणामस्वरूप बिखरे हुए भूखंड शोर होंगे, फिर भी यदि फ़िल्टरिंग सेट किया जाता है तो बहुत अधिक महत्वपूर्ण म्यूटेंट समाप्त हो सकते हैं।
    6. नकली-उपचारित पटरियों की संख्या/अच्छी तरह से म्यूटेनेड पटरियों की संख्या को विभाजित करके ईएमएस के कारण होने वाली प्रतिशत मृत्यु दर की गणना करें । मॉक-ट्रीट किए गए पटरियों की संख्या को 3 के प्रारंभिक कमजोर पड़ने वाले कारक द्वारा गुणा करें ताकि मॉक-ट्रीट किए गए पटरियों की संख्या की गणना की जा सके । इस कार्य को करने के लिए गणना समावेश पटरियों का उपयोग करें और प्रतिशत मृत्यु कोशिकाओं की गणना करें।
    7. गणना सेल का उपयोग कर प्रत्येक ट्रैक के लिए जल्दी और देर दोनों संवाददाताओं के लिए आधा अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए समय की गणना करें । इन मूल्यों का उपयोग विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने के लिए उत्परिवर्तनीय और नकली आबादी की तुलना करने के लिए किया जाएगा।
    8. हाफ-मैक्स प्लॉट सेल के भीतर प्रत्येक प्रमोटर की आधी-अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए समय की कल्पना करने के लिए बोकेह प्लॉटिंग पैकेज का उपयोग करते हैं, जो एचसीटीबीप्रोम के खिलाफ यूओप्रोम समय को आधा अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए रेखांकन करते हैं। बोकेह इंटरैक्टिव ट्रैक आईडी एक्सप्लोरर का उपयोग करके नकली-इलाज स्कैटर क्लाउड के बाहर आने वाली उत्परिवर्ती आबादी से समावेशन की पहचान करें। एफएवी और XY के निर्देशांक पर ध्यान दें ब्याज के समावेशन(चित्रा 2)के ।
      नोट: प्रत्येक क्लोन के सत्यापन और सांख्यिकीय मूल्यांकन के रूप में नियंत्रण क्लाउड के बाहर नेत्रहीन रूप से आने वाले उम्मीदवार समावेशन को बाद में किया जाएगा।
    9. एनिमेटेड प्लॉट सेल के भीतर प्लॉटिंग टूल प्लॉटली16का उपयोग करके एचसीटीबीसालाना जलसे के खिलाफ यूओसालाना जलसे की अभिव्यक्ति तीव्रता को ग्राफ करके समय के माध्यम से प्रमोटर अभिव्यक्ति गतिज में परिवर्तन की कल्पना करें । प्लॉटली के स्कैटर फंक्शन का उपयोग समय के साथ जीन अभिव्यक्ति को चेतन करने के लिए किया जाता है(वीडियो 1)।
    10. शामिल लोकेटर सेल में प्लॉटली एनिमेटेड ग्राफ से एक स्नैपशॉट की कल्पना करें, एक विशिष्ट समय बिंदु (यानी 28 एचपीआई) पर यूओ प्रोमअभिव्यक्ति की साजिश रचते हुए बोकेह पैकेज(चित्रा 3)का उपयोग करके। चरण 3.3.8 में वर्णित उत्परिवर्ती आबादी से समावेशन की पहचान करें।
      नोट: इस विश्लेषण को जल्दी से (<4 h) करने की जरूरत है क्योंकि समावेशन अभी भी विस्तार कर रहे हैं और संक्रमण के बाद मेजबान कोशिकाओं को ~ 48 घंटे से बाहर करना शुरू कर देंगे।
  4. विकासात्मक म्यूटेंट को ब्याज के समावेशन से अलग करें
    नोट: क्लैमाइडिया को समावेशन से अलग करने के लिए जो बदल जीन विनियमन प्रदर्शित करने के लिए निर्धारित किए गए थे, केशिका सुइयों के साथ एक माइक्रोमैनीपुलेटर नियोजित किया गया था । धारा 3.3 में डेटा विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग करके ब्याज के समावेशन के वेल आईडी, एफओवी और एक्स, वाई निर्देशांक निर्धारित किए गए थे।
    1. एक लौ में केशिका ट्यूब के केंद्र को पकड़कर केशिका सुइयों को तैयार करें और केशिका ट्यूब के दोनों सिरों को तब तक खींचें जब तक कि यह अलग न हो जाए। एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर खींचा टिप तोड़कर खींचा केशिका सुई में एक खोलने बनाएं। सुई को तोड़ने के लिए, एक कोण पर माइक्रोस्कोप स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए हिस्से पर बंद टिप रखें और दबाव लागू करें।
      नोट: केपिलरी ट्यूब स्पेसिफिकेशन 1.0 मिमी O.D., 0.5 मिमी I.D. थे।
    2. जांच करें कि सुई खोलने लगभग एक माइक्रोस्कोप, 20x उद्देश्य के तहत एक शामिल करने का आकार है ।
    3. उम्मीदवार समावेशन (प्रति समावेशन एक सुई) के अलगाव के लिए प्रीपुल ~ 25-30 केशिका सुई।
    4. माइक्रोइंजेक्टर को खनिज तेल के साथ भरें ताकि यह सुनिश्चित किया जा रहे कि कोई हवा के बुलबुले मौजूद न हों।
    5. माइक्रोइंजेक्टर के लिए एक ग्लास केशिका सुई संलग्न करें और सुई की नोक पर तेल निष्कासित, किसी भी हवा बुलबुले निकाल । पूर्ण मीडिया में केशिका सुई रखें और आधे रास्ते तक मीडिया को आकर्षित करें। मीडिया के साथ केशिका सुई भरना कुएं में तेल संदूषण को रोकता है।
    6. चरण 2.3.5 से μManager में सहेजे गए स्थिति सूची का उपयोग करना, पायथन विज़ुअलाइज़ेशन नोटबुक में पहचाने गए ब्याज को शामिल करने के कुएं और एफओवी में स्थानांतरित करें।
    7. ब्याज के शामिल किए जाने के XY निर्देशांक के लिए केशिका सुई स्थानीयकरण करने के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर की जॉयस्टिक का उपयोग करें।
    8. ५९५ एनएम उत्तेजन चैनल का उपयोग करने के लिए निष्कर्षण के लिए EBs कल्पना और चरण/ शामिल करने के लिए केशिका सुई पैंतरेबाज़ी, शामिल करना टूटना और फिर माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग कर केशिका सुई में EBs आकर्षित ।
    9. चरण 2.1.2 में तैयार तैयार 24 अच्छी तरह से पॉलीस्टीरिन प्लेट के एक कुएं में केशिका सुई से ईबी निष्कासित करें। केशिका सुई निकालें और अगले समावेश निष्कर्षण के लिए एक ताजा केशिका सुई के साथ बदलें। सभी उम्मीदवार समावेशन के लिए धारा 3.4 दोहराएं।
      नोट: विस्तार के लिए और री-इमेजिंग के लिए एक उच्च पर्याप्त टाइटर सुनिश्चित करने के लिए, 5% सीओ2,37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में म्यूटेंट आइसोलेट को तब तक अलग करता है जब तक कि अधिकांश मेजबान कोशिकाएं संक्रमित न हों (~ 1 सप्ताह)। कुओं पर बारीकी से नजर रखी जानी चाहिए क्योंकि विभिन्न आइसोले विभिन्न विकास दरों को प्रदर्शित कर सकते हैं ।
  5. हार्वेस्ट उत्परिवर्ती आइसोलेशन
    1. बर्फ पर, 1 एमएल माइक्रोपिपेट टिप के साथ स्क्रैप करके संक्रमित मोनोलेयर को बाधित करें। मीडिया, सेल मलबे को स्थानांतरित करें, और क्लैमाइडिया को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में जारी किया।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा गोली क्लैमाइडिया, और 14,000 x g. बर्फ ठंड 1x एसपीजी के 75 माइक्रोन में सुपरनेट और रिसिस्टलेट गोली निकालें। तीन 1.5 एमएल स्क्रू-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में अलीकोट। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. उत्परिवर्ती आइसोल्ट फेनोटाइप का सत्यापन

  1. इमेजिंग म्यूटेजेनाइज्ड आइसोलेशन के लिए होस्ट सेल कल्चर
    1. 1.6 x 104 Cos-7 कोशिकाओं (एटीसीसी) के साथ एक 96 अच्छी तरह से ग्लास बॉटम प्लेट को पूरा मीडिया के 100 माइक्रोन में बीज करें। 5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। कोशिकाओं को लगभग 24 घंटे में उदारता तक पहुंचना चाहिए। कोशिकाओं के ढुलमुल होने के बाद, मीडिया को 1 μg/mL cycloheximide के साथ पूरक पूर्ण मीडिया के साथ प्रतिस्थापित करें, रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. उम्मीदवार के साथ कोशिकाओं को संक्रमित फेनोटाइपिक सत्यापन के लिए अलग करता है
    1. बर्फ पर उत्परिवर्ती क्लोन और वाइल्डटाइप क्लैमाइडिया गल।
    2. तैयार 96 अच्छी प्लेट में, एक कॉलम प्रति आइसोलेड (11 कॉलम) का उपयोग करके उत्परिवर्ती आइसोलेशन के दो गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। 100 माइक्रोन एचबीएसएस में 1:20 के प्रारंभिक कमजोर पड़ने के साथ शुरू करें।
      नोट: क्लैमाइडिया का धारावाहिक कमजोर पड़ने का कार्य यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि उत्परिवर्ती नमूनों को एमओआई और लेफ्टिनेंट; 1 पर चित्रित किया जाए।
    3. एमओआई ~ 0.5 पर वाइल्डटाइप क्लैमाइडिया के साथ शेष (12 वीं) कॉलम को संक्रमित करें।
      नोट: वाइल्डटाइप क्लैमाइडिया का उपयोग म्यूटेजेनाइज्ड आइसोले के खिलाफ तुलना के लिए नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट कमाल के लिए इनक्यूबेट।
    5. सेक्शन 2.2 में निर्दिष्ट के रूप में हेपरिन और एचबीएसएस के 1 मिलीग्राम/एमएल के साथ प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) एचबीबीएस के साथ संक्रमित मेजबान कोशिकाओं को धोएं।
    6. प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) इमेजिंग मीडिया के प्रति कुएं 200 माइक्रोन के साथ बदलें।
    7. इंटरवेल रिक्त स्थान को प्रीवार्मेड (37 डिग्री सेल्सियस) डिओनाइज्ड एच2ओ के साथ भरें।
    8. 5% सीओ2पर इनक्यूबेट, 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
  3. माइक्रोस्कोप सेटअप
    नोट: माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए धारा 2.3 का उल्लेख करें, इस अनुभाग में केवल आवश्यक सेटअप संशोधन होंगे।
    1. एचसीएस प्लगइन से 96 वेल प्लेट टेम्पलेट का चयन करें।
    2. अनुभवजन्य रूप से प्रत्येक उत्परिवर्ती आइसोरेंट के लिए एक एमओआई और लेफ्टिनेंट; 1 के अनुरूप कुओं का निर्धारण करते हैं। यूओ प्रमोटर के नियंत्रण में क्लोवर अभिव्यक्ति ~ 10 एचपीआई पर नमूदार है जो समावेशन का प्रारंभिक दृश्य संभव(चित्रा 1B)बना रही है।
    3. म्यूटेंट आइसोलेड प्रति तीन कुओं का चयन करें जो एक एमओआई और लेफ्टिनेंट के अनुरूप हैं; 1 और एक इमेजिंग स्थिति सूची उत्पन्न करें जिसमें दो एफओवी शामिल हैं।
      नोट: हार्डवेयर की कमी के कारण केवल 72 छवियों को प्रति समय अंतराल लिया जा सकता है, यदि 12 नमूनों को इमेज किया जाता है तो यह दो इमेजिंग साइटों का उपयोग करके प्रति तनाव तीन कमजोर पड़ने (कुओं) के बराबर होता है।
    4. 12 एचपीआई से शुरू होने वाले 30 मिनट के समय अंतराल पर प्रत्येक उत्परिवर्ती आइसोलेड के विकास चक्र को 30 मिनट के समय अंतराल पर रिकॉर्ड करें।
    5. अधिग्रहण टिप्पणियां बॉक्स में प्रायोगिक विवरण रिकॉर्ड करें। यानी, अच्छी तरह से ABC1: वाइल्डटाइप नियंत्रण। खैर ABC2: उत्परिवर्ती तनाव 1, ABC3: उत्परिवर्ती तनाव 2, आदि.. । इमेजिंग: 12-48 एचपीआई।
    6. 12 एचपीआई पर छवि अधिग्रहण शुरू करें।

5. अलग सत्यापन के लिए डेटा विश्लेषण

  1. इन-फोकस छवि ढेर बनाएं और व्यक्तिगत समावेशन में फ्लोरेसेंस अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करें
    1. धारा 3.1 - 3.2 में निर्दिष्ट प्रत्येक समावेश के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता के निशान उत्पन्न करें।
  2. सीटीआर म्यूटेजेनाइज्ड आइसोलेशन को सत्यापित करें
    नोट: उत्परिवर्ती आइसोले के परिवर्तित विकासात्मक प्रोफाइल को सत्यापित करने के लिए, उनकी अभिव्यक्ति प्रोफाइल की तुलना पायथन नोटबुक का उपयोग करके वाइल्डटाइप अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल से की जाती है। परिवर्तित विकासात्मक प्रोग्रामिंग के साथ उत्परिवर्ती क्लोन के सत्यापन के लिए उपयोग की जाने वाली पायथन नोटबुक पूरक डेटा(clone_check-मार्कडाउन)में प्रदान की जाती है।
    1. धारा 3.3 में किए गए clone_check-मार्कडाउन पायथन नोटबुक में इन्क्लूजन ट्रेस डेटा का आयात और फ़िल्टर करें।
    2. गणना मीन और एसटीडी सेल का उपयोग करके प्रत्येक अलग और वाइल्डटाइप नियंत्रण जनसंख्या के निशान से मतलब और मानक विचलन (एसटीडी) की गणना करें।
    3. ग्राफ आईएसओ बनाम डब्ल्यूटी सेल प्लॉट के साथ वाइल्डटाइप नियंत्रण के खिलाफ प्रत्येक उत्परिवर्ती क्लोन के मतलब (एसईएम) की औसत और मानक त्रुटि यह निर्धारित करने के लिए कि क्या उत्परिवर्ती अभिव्यक्ति काइनेटिक्स वाइल्डटाइपनमूने (चित्रा 4)से अलग हैं।
    4. निर्धारित करें कि क्या अलग उत्परिवर्ती आबादी उत्परिवर्ती निशान की साजिश रचकर क्लोन है और उनकी तुलना धारा 3.3 (चरण 3.3-3.3.10)(चित्रा 2, चित्रा 3)में किए गए एक स्कैटर प्लॉट का उपयोग करके वाइल्डटाइप समावेशन निशान से की जाती है। यदि अलग एक मिश्रित आबादी साजिश एक वाइल्डटाइप और वाइल्डटाइप तितर बितर बादल के बाहर एक दूसरी अलग आबादी के साथ ओवरलेइंग आबादी दिखाएगा । यदि जनसंख्या मिश्रित दिखती है तो धारा 3.4 में वर्णित मूल प्रक्रिया का उपयोग करके उत्परिवर्ती को फिर से अलग किया जा सकता है।
      नोट: यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एक आइसो आइसोर्स का विकासकंप सांख्यिकीय रूप से अलग है, प्रत्येक आइसोर्स के लिए घटता है की तुलना एनोवा का उपयोग करके वाइल्डटाइप से की जानी चाहिए।

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Representative Results

हमारे प्रमोटर-रिपोर्टर क्लैमिडियल स्ट्रेन के डायरेक्ट ईएमएस म्यूटेनेसिस के परिणामस्वरूप संक्रमितता में ~ 75% की कमी हुई। वर्णित लाइव-सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ~ 600 समावेशन को 24 घंटे की अवधि में चित्रित और ट्रैक किया गया था। प्रत्येक समावेश में दोनों संवाददाताओं की फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति काइनेटिक्स कस्टम पायथन नोटबुक लिपियों का उपयोग करके कल्पना की गई थी। अलगाव के लिए उम्मीदवार म्यूटेनेनाइज्ड क्लैमाइडिया की पहचान करने के लिए दो विज़ुअलाइज़ेशन दृष्टिकोण लागू किए गए थे। पहली पद्धति (चरण 3.3.8) यूओ और एचसीटीबी प्रमोटरों की आधी अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए एक इंटरैक्टिव स्कैटर प्लॉट(चित्रा 2)में व्यक्तिगत क्लैमिडियल आइसोलेट से समय की कल्पना करती है। समावेशन अलगाव के लिए पहचान की गई अगर वे नकली इलाज तितर बितर बादल के बाहर गिर गया । उंमीदवार क्लोन उठाया गया है कि नेत्रहीन नियंत्रण बादल के बाहर गिर गया । बाद में प्रत्येक क्लोन का सत्यापन किया गया। क्लोन A3-6-67 और B3-8-58 अलगाव के लिए चुना गया था के रूप में वे यूओ प्रमोटर से आधा अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए कम समय का उत्पादन किया और hctB (चित्रा 2)के लिए अब समय ।

परिवर्तित काइनेटिक्स (चरण 3.3.9-10) के साथ समावेशन की पहचान करने के लिए दूसरी दृश्य विधि दो प्रमोटरों(वीडियो 1)से गतिशील जीन अभिव्यक्ति के दृश्य के आधार पर व्यक्तिगत समावेशन की पहचान करती है। फिर, गतिशील समावेशन अभिव्यक्ति पैटर्न के साथ उम्मीदवार क्लोन जो नियंत्रण समावेशन से काफी अलग थे, उन्हें चुना गया। B3-6-62 23 और 29 HPI(वीडियो 1)के बीच यूओ प्रमोटर से वृद्धि हुई फ्लोरोसेंट संचय के कारण चुना गया था । एनिमेटेड ग्राफ का एक स्नैपशॉट ब्याज के समावेशन(चित्रा 3)के स्थान की पहचान करने के लिए लिया गया था ।

दो दृश्य विधियों का उपयोग करके, अलगाव के लिए कुल 24 समावेशन की पहचान की गई थी। 24 कुल आइसोलेट में से 10 ने पुनर्परीक्षण पर अंतर गतिज दिखाई । ये आइसोलेट तीन फेनोटाइपिक श्रेणियों में गिर गए; 8 आइसोले प्रदर्शित ~ 24 एचपीआई पर कम यूओप्रोम अभिव्यक्ति, आरबी-ईबी रूपांतरण के समय के अनुरूप, जैसा कि क्लोन A3-6-67(चित्रा 4A)द्वारा प्रदर्शित किया गया है। शेष दो क्लोन अद्वितीय फेनोटाइपिक प्रोफाइल प्रदर्शित, B3-8-58 अलग भी ~ 24 HPI पर कम euoप्रोम अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया, अभी तक HCTBसालाना जलसे अभिव्यक्ति(चित्रा 4B)में एक समग्र वृद्धि हुई है, जबकि B3-6-62 euo प्रमोटर से फ्लोरेसेंस के स्तर में वृद्धि हुई दोनों प्रमोटरों(चित्रा 4)में अभिव्यक्ति की अचानक हानि के बाद व्यक्त की । उत्परिवर्ती बी 3-6-62 के लिए लाइव-सेल माइक्रोग्राफ के विश्लेषण से पता चला है कि मेजबान सेल लाइसिस इस उत्परिवर्ती से संक्रमित कोशिकाओं में वाइल्डटाइप संक्रमित कोशिकाओं(वीडियो 2)की तुलना में बहुत पहले हुआ था।

Figure 1
चित्रा 1: सीटीआर प्रमोटर-रिपोर्टर्स के साथ सेल-प्रकार के विकास की निगरानी करना।
(A)प्रमोटर-रिपोर्टर निर्माण की योजनाबद्ध, p2TK2-hctB सालाना जलसे-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर ।-hctBeuo (B) यूओप्रोम-क्लोवर का लाइव-सेल माइक्रोग्राफ और सीटीआर में एचसीटीबीप्रोम-एमकेटे2 एक्सप्रेशन 10 एचपीआई(सी)सीटीआर के लाइव-सेल माइक्रोग्राफ में यूओप्रोम-क्लोवर और एचसीटीबीप्रोम-एमकेटे2 को 36 एचपीआई पर व्यक्त किया गया। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि की पहचान प्रत्येक प्रमोटर के लिए आधा अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए समय के दृश्य द्वारा A3-6-67 और B3-8-58 अलग करती है ।
इंटरैक्टिव ग्राफ का उपयोग म्यूटेग्नाइज्ड क्लैमाइडिया की पहचान करने के लिए किया जाता है जो अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्रदर्शित करता है जो नकली-इलाज नियंत्रण स्कैटर क्लाउड से अलग होता है। ग्राफ पर प्रत्येक स्थान एक ही समावेश का प्रतिनिधित्व करता है। समावेशन स्पॉट A3-6-67 और B3-8-58 पर प्रकाश डाला जाता है क्योंकि वे नकली-इलाज बादल के बाहर आते हैं, दोनों ने यूओ प्रमोटर की आधी-अधिकतम अभिव्यक्ति के लिए कम समय का प्रदर्शन किया है, जो लंबे समय से एचसीटीटीबीकी आधी अधिकतम अभिव्यक्ति के साथ संयोजन में है । यूओसालाना जलसे: एक्स-एक्सिस, एचसीटीबीसालाना जलसे: वाई-एक्सिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: शामिल स्थान की पहचान के लिए इंटरएक्टिव स्नैपशॉट।
प्रस्तुत ग्राफ एनिमेटेड स्कैटर प्लॉट(वीडियो 1)से 28 एचपीआई पर एक स्नैपशॉट है और इसका उपयोग ब्याज के समावेशन के एफओवी और एक्सवाई समन्वय स्थान की पहचान करने के लिए किया गया था। B3-6-62 दिखाया गया है के रूप में यह एनिमेटेड तितर बितर साजिश से अलगाव के लिए चुना गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: प्रतिनिधि उत्परिवर्ती आइसोलेशन का सत्यापन।
म्यूटेजेनाइज्ड के विकासात्मक प्रोफाइल A3-6, B3-8 और B3-6 को अलग करते हैं। (ए)A3-6 उत्परिवर्ती ~24 एचपीआई पर एक कमी यूओप्रोम अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है । (ख)B3-8 उत्परिवर्ती अलग ~24 HPI पर एक कमी euoप्रोम अभिव्यक्ति दर्शाती है, लेकिन hctBप्रोम अभिव्यक्ति में एक समग्र वृद्धि हुई है । (ग)बी 3-6 आइसोसेट प्रदर्श यूओप्रोम अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि हुई है और इसके बाद दोनों प्रमोटरों में ~४० एचपीआई पर अभिव्यक्ति का अचानक नुकसान हुआ । प्रत्येक नमूना निर्दिष्ट आबादी का औसत है, एन और जीटी; 25। बादल SEM का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रमोटर के निर्देशित आगे आनुवंशिक विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह-रिपोर्टर Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctB प्रोम-mKate2/euo प्रोम-क्लोवर ईबी सीधे एक्सीनिक मीडिया, सीआईपी-1 में ईएमएस के साथ उत्परिवर्तन किया गया ।hctBeuo इमेजिंग और फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कॉस-7 सेल मोनोलेयर को संक्रमित करने के लिए म्यूटेजेनाइज्ड ईबी का उपयोग किया गया था। क्लैमाइडिया ने बदल विकासात्मक गतिशीलता को व्यक्त करते हुए इंटरैक्टिव रेखांकन में दृश्य द्वारा पहचाना गया था। बदल विकास प्रोफाइल के साथ समावेशन एक माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग कर अलग थे । आइसोलेशन के फेनोटाइप को पुनर्संरस्तु पर सत्यापित किया गया था। उत्परिवर्ती आइसोलेट्स को फेनोटाइप से जुड़े डीएनए घावों की पहचान करने के लिए डब्ल्यूजीएस के अधीन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: एक गतिशील जीन अभिव्यक्ति साजिश का उपयोग कर अलग अभिव्यक्ति काइनेटिक्स का प्रदर्शन mutagenized क्लैमाइडिया की पहचान । व्यक्तिगत समावेशन के लिए यूओ और एचसीटीबी की प्रमोटर अभिव्यक्ति को बदले हुए अभिव्यक्ति गतिशीलता के साथ म्यूटेग्नाइज्ड क्लैमाइडिया की पहचान करने के लिए समय के माध्यम से प्लॉट और कल्पना की गई थी। B3-6-62 अलगाव के लिए चुना गया था के रूप में यह वाइल्डटाइप बादल की तुलना में उच्च यूओप्रोम अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है । यूओसालाना जलसे: एक्स-एक्सिस, एचसीटीबीसालाना जलसे: वाई-एक्सिस। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 2: प्रतिनिधि उत्परिवर्ती B3-6-62 समय से पहले मेजबान-सेल lysis का कारण बनता है । बी 3-6-62 संक्रमित मेजबान-कोशिकाओं के समय-चूक लाइव-सेल माइक्रोग्राफ समय से पहले लाइसिस (~ 40 एचपीआई) से गुजरते हैं। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइलें। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्लैमिडियल विकासात्मक चक्र को नियंत्रित करने वाले तंत्रों को विच्छेदन वर्तमान में उपलब्ध आनुवंशिक उपकरणों की सीमाओं से बाधित किया गया है । लाइव-सेल स्वचालित माइक्रोस्कोपी के साथ हमारे प्रमोटर-रिपोर्टर क्लैमाइडिया को नियोजित करते हुए, एक प्रणाली बनाई गई थी जो 24 घंटे की अवधि में व्यक्तिगत समावेशन में सेल-प्रकार के विकास की निगरानी में सक्षम बनाती है। इस प्रणाली, रासायनिक म्यूटेनेसिस और प्रत्यक्ष समावेश अलगाव के संयोजन में तेजी से और क्लोनी रूप से बदल विकास प्रोफाइल(चित्रा 5)व्यक्त क्लैमाइडिया का चयन करने के लिए एक विधि की स्थापना की है ।

क्लैमाइडियल ईबीएस मेजबान के बाहर मेटाबोलिक रूप से सक्रिय होते हैं जब इंट्रासेलुलर आयनिक की स्थिति और ऊर्जा स्रोत5,,12प्रदान किया जाता है। इस ईबी एक्सनिक मेटाबोलिज्म को मेजबान कोशिकाओं के बाहर शुद्ध ईबी को म्यूटेजेनाइज करने के लिए लीवरेज किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, मेटाबोलाइजिंग ईबी को सीधे ईएमएस के साथ म्यूटेजेनाइज्ड किया गया था। यह देखा गया कि ईएमएस उपचार ने ईबी व्यवहार्यता को प्रभावी ढंग से कम कर दिया और ईबी उत्पन्न किया जो उम्मीद के अनुसार परिवर्तनीय विकासात्मक गतिज का उत्पादन करता है।

यह अनुमान लगाया गया है कि वर्णित ईएमएस म्यूटानेसिस प्रोटोकॉल ~ 5-20 डीएनए परिवर्तन/ईबी उत्पन्न करता है। लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी वर्कफ्लो वर्णित दृश्य (FOV) के क्षेत्र प्रति ~ 8 समावेशन और 30 मिनट के अंतराल में हर 72 FOVs इमेजिंग करने में सक्षम है। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया है कि प्रति रन ~ 3000-10,000 म्यूटेशन के प्रभावों की कल्पना की जा सकती है। कई रन (3-5) 9000-50,000 म्यूटेशन के प्रभाव के दृश्य में परिणाम होगा । सीटीआर-एल2 जीनोम ~ 850 जीन को एन्कोड करता है, इस प्रोटोकॉल का सुझाव देने से प्रति जीन और 10 म्यूटेशन का दृश्य होगा। इन अनुमानों से संकेत मिलता है कि जीनोम कवरेज, जबकि पूरा नहीं, पर्याप्त होना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल की ताकत के पास वास्तविक समय में एकल समावेश संकल्प पर कई प्रमोटर-संवाददाताओं की अभिव्यक्ति काइनेटिक्स को ट्रैक और रिकॉर्ड करने की क्षमता है । फॉरवर्ड जेनेटिक्स नमूदार फेनोटाइप और क्लोनल अलगाव पर निर्भर करता है। क्लैमाइडिया में फॉरवर्ड जेनेटिक्स के लिए पिछले तरीकों ने स्थिर टिप्पणियों पर भरोसा किया और आगर ओवरले8के साथ प्लाकी । हमारी कार्यप्रणाली के साथ, गतिशील प्रमोटर गतिविधि पूरे विकासात्मक चक्र में दर्ज की जाती है और फिर उन समावेशन की पहचान करने के लिए कल्पना की जाती है जिनमें परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति काइनेटिक्स के साथ क्लैमाइडिया होते हैं। कई मापदंडों का उपयोग करके उम्मीदवार समावेशन की पहचान करना (यानी, एक दिए गए समय बिंदु पर आधा अधिकतम अभिव्यक्ति और कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता का समय) अलग-अलग उत्परिवर्ती पूल में परिणाम देता है जो विभिन्न विकासात्मक गतिज प्रदर्शित करता है। इन क्लैमाइडिया में अद्वितीय उत्परिवर्तन होने की संभावना है जो अलग आनुवंशिक रास्तों के नियमन को प्रभावित करते हैं। तथ्य यह है कि इन प्रोफाइल को लाइव दर्ज किया जा सकता है और कुछ घंटों के बाद कल्पना की जा सकती है, संक्रमित मोनोलेयर से ब्याज के समावेशन का पता लगाने और अलग करने के लिए समय की अनुमति देता है। हालांकि हम विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता पर ध्यान केंद्रित किया, वैकल्पिक जीन संवाददाताओं अंय नियामक रास्ते की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

पूछताछ की जा रही आनुवंशिक रास्तों के आधार पर, कोशिकाओं की मेजबानी के लिए साइक्लोहेक्सीमाइड के अलावा सावधानी बरती जानी चाहिए । हालांकि साइक्लोहेक्सीमाइड के साथ इनक्यूबेशन मेजबान कोशिकाओं की प्रतिकृति को अवरुद्ध करके मोनोलेयर की इमेजिंग विशेषताओं में सुधार करता है; यह प्रभाव मेजबान प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करने के माध्यम से प्राप्त किया जाता है। डी नोवो होस्ट प्रोटीन संश्लेषण का अवरोध पूछे गए प्रश्न के आधार पर आनुवंशिक स्क्रीन के परिणामों को प्रभावित कर सकता है।

फोटोकॉक्सीसिटी और फोटोब्लैचिंग लंबे समय तक चूक माइक्रोस्कोपी में बड़ी बाधाएं हैं । इन मुद्दों को दूर करने के लिए, प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की विशिष्ट विशेषताओं को प्रयोग से पहले माना जाना चाहिए। क्लोवर और एमकेटे2 में कम परिपक्वता समय (20-30 मीटर) फोटोस्टेबल होते हैं, और अपेक्षाकृत बड़ी क्वांटम पैदावार17,,18का प्रदर्शन करते हैं। ये गुण उत्तेजन तीव्रता और एक्सपोजर समय को कम करने की अनुमति देते हैं, इस प्रकार फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लैचिंग की मात्रा को कम करते हैं। चरण/डीआईसी व्हाइट लाइट चैनल को ऑटोफोकसिंग के लिए नियोजित किया गया था क्योंकि प्रकाश का यह स्पेक्ट्रम क्लैमाइडिया के लिए कम फोटोटॉक्सिक था ।

इस प्रोटोकॉल के लिए ईएमएस को केमिकल म्यूटेन के तौर पर इस्तेमाल किया गया था। ईएमएस का कारण बनता है जी: सी से ए: टी संक्रमण के माध्यम से गुआनाइन एल्किलेशन19। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का विस्तार वैकल्पिक म्यूटेजेन शामिल करने के लिए किया जा सकता है जो अन्य प्रकार के जीनोमिक म्यूटेशन को प्रेरित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक्रिडीन डीएनए इंटरकैलिटिंग यौगिकों का एक वर्ग है जो इनडेल्स को प्रेरित करता है, फ्रेम शिफ्ट की संभावना बढ़ाता है और इसलिए म्यूटेशन20को अशक्त करता है।

क्लैमिडियल परिवर्तन तकनीकों में प्रगति के साथ, फेनोटाइप पूरक समूहों से जुड़े उत्परिवर्तित जीन को जीनोटाइप-फेनोटाइप लिंकेज9के सत्यापन के लिए सम्मिलित जीन व्यवधान और आनुवंशिक पूरकता के माध्यम से खटखटाया जा सकता है। आरबी को ईबी विकास के लिए आरबी ब्लॉक करने वाले म्यूटेंट को ठीक करना समस्याग्रस्त हो सकता है क्योंकि ब्याज के उत्परिवर्तन क्लैमाइडिया का उत्पादन कर सकते हैं जो मेजबान कोशिकाओं को फिर से शामिल नहीं कर सकते हैं। सांख्यिकीय संघों (जीवाए) द्वारा विकासात्मक जीन की पहचान करने के लिए इस तकनीक को संशोधित किया जा सकता है। अलग समावेशन से क्लैमाइडिया के जीनोम को विस्तार और सत्यापन के बिना सीधे अनुक्रमित किया जा सकता है। इस तकनीक की उच्च थ्रूपुट प्रकृति सांख्यिकीय संघों को संभव बना देगी। फिर, जीन व्यवधान और पूरकता9के माध्यम से इन संघों के सत्यापन का परीक्षण किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम सीआईपी-1 एक्सनिक मीडिया की आपूर्ति के लिए वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी में डॉ ऐंडर्स ओम्सलैंड को धन्यवाद देते हैं । इस काम को एनआईएच ग्रांट R01AI130072, R21AI135691 और R21AI113617 ने सपोर्ट किया । इडाहो विश्वविद्यालय और उनके NIH अनुदान P20GM104420 के माध्यम से मॉडलिंग जटिल इंटरैक्शन के लिए केंद्र से स्टार्टअप फंड द्वारा अतिरिक्त सहायता प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well polystyrene plates Corning 3524 Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates Cellvis P06-1.5H-N Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates Nunc 165305 Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit OKO Labs CO2 UNIT BL Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit OKO Labs H301-T-UNIT-BL-PLUS Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes Sutter Instrument B1005010 Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) Semrock FF01-514/30-25 Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) Semrock FF02-641/75-25 Fluoescent filter cube
CellTram Vario Eppendorf 5196000030 Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2 ATCC VR-577 Chlamydia trachomatis
CIP-1 media In house NA Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5
mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and
CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC) ATCC CRL-1651 African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide MP Biomedicals 194527 Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99% Acros Organics AC205260100 Mutagen
Fetal Plex Gemini Bio-Products 100-602 Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ https://imagej.net/Fiji NA Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator Eppendorf CO1700100X Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) Integrated DNA Technologies NA gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml Gibco 15710-064 Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Corning 21-020-CM Host cells rinse
Heparin sodium Amersham Life Science 16920 inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M GE Life Sciences SH30237.01 pH buffer for growth media
InjectMan Eppendorf 5179 000.018 Micromanipulator
Jupyter Notebook https://jupyter.org/ NA Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3 Sutter Instrument LB10-3 Filter wheel controler
Oko Touch OKO Labs Oko Touch Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage Prior H107 Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge Labnet C2500-R Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven Labnet H1200A Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II Prior H30V4 XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet Labconco 362804 Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red) Gibco 11835-030 Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red) GE Life Sciences SH30027.01 Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) scopeLED F140 Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500 Fisher Scientific 15-338-550 Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator OKO Labs H301-K-FRAME Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) In house NA Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks Thermo Scientific 156499 Cell culture growth
TE 300 inverted microscope Nikon 16724 microscope
THOR LED Thor Labs LEDD1B White light
Trypsin Corning 25-052-CI Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS Andor ZYLA-5.5-USB3 imaging camera
µManager 2.0gamma https://github.com/micro-manager/micro-manager NA Open sourse automated microscope control software package

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 160 फॉरवर्ड जेनेटिक्स रासायनिक म्यूटेनेसिस क्लैमिडियल विकास लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी स्वचालित माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स
<em>क्लैमाइडिया ट्रेकोमेटिस</em> में विकासात्मक म्यूटेंट की पहचान करने और उन्हें अलग करने के लिए लाइव-सेल फॉरवर्ड जेनेटिक दृष्टिकोण
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Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (160), e61365, doi:10.3791/61365 (2020).

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