הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים
Summary
פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.
Abstract
קהילות פולימיקרוביאליות נמצאות בכל מקום בטבע, אך לימוד האינטראקציות שלהן ברמת התא הבודד קשה. לכן, שיטה מבוססת מיקרוסקופ פותחה להתבוננות אינטראקציות בין מינים בין שני פתוגנים חיידקיים. השימוש בשיטה זו כדי לחקור אינטראקציות בין פתוגן גראם שלילי תו לא, פסאודומונס aeruginosa ופתוגן גראם-חיובי שאינו מוטיב, Staphylococcus aureus מדגים כאן. פרוטוקול זה מורכב מאחסון משותף של כל מין בין כיסוי לבין משטח agarose, אשר שומר על התאים במטוס אחד ומאפשר הדמיה של התנהגויות חיידקים הן במרחב והן בזמן.
יתר על כן, המיקרוסקופ הזמן לשגות הפגינו כאן הוא אידיאלי עבור הדמיית אינטראקציות מוקדמות המתקיימות בין שני מינים חיידקיים או יותר, כולל שינויים בתנועבת מינים חיידקיים במונוקולטורה ובcoculture עם מינים אחרים. בשל אופיו של שטח המדגם המוגבל בהגדרת המיקרוסקופ, פרוטוקול זה פחות ישים ללימוד אינטראקציות מאוחרות יותר בין מינים חיידקיים ברגע שאוכלוסיות התאים גבוהות מדי. עם זאת, ישנם מספר יישומים שונים של הפרוטוקול הכוללים את השימוש בכתמים עבור הדמיה תאים חיידקיים חיים ומתים, כימות של ביטוי גנים או חלבון באמצעות כתבים פלורסנט, ומעקב אחר תנועת תאים חיידקיים בשני מינים בודדים וניסויים מרובי מינים.
Introduction
קהילות פולימיקרוביאליות נפוצות בטבע, המשתרעות על פני מגוון רחב שלאיכות הסביבה 1,,2,,3 ונישות אנושיות 4,,5. חלק מהזיהומים הפולימיקרוביאליים הידועים לשמצה ביותר במחלה האנושית כוללים ביופילםדנטלי 6,פצעים כרוניים 7,8 ,וזיהומיםבדרכי הנשימה באנשים עם מחלתריאות חסימתית כרונית 9, דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה10, ואת המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF)11,12. זיהומים אלה מורכבים לעתים קרובות של מינים מיקרוביאליים מגוונים; עם זאת, לאחרונה להתמקד באינטראקציות בין החיידק גראם חיובי Staphylococcus aureus ואת החיידק גראם שלילי פסאודומונס aeruginosa הגיח. מחקרים הכוללים חולים הנגועים באורגניזמים אלה וניתוחים במבחנה חושפים הן אינטראקציות תחרותיות והן אינטראקציות שיתופיות שיכולות להיות השפעות עמוקות ובלתי צפויות על התקדמות המחלה, הישרדות מיקרוביאלית, ויריות, חילוף חומרים, ורגישותלאנטיביוטיקה (נבדקבפירוט על ידי Hotterbeekx ואח ‘. 201713 ו לימולי והופמן 2019 3 ).
העניין הגובר באינטראקציות בין מינים במהלך הזיהום הניב מגוון שיטות לחקר התנהגויות קהילתיות פולמיקרוביאליות. בדרך כלל, מחקרים אלה השתמשו צלחת או מבוסס מרק ים כדי לחקור את ההבדלים פנוטיפיים בין monoculture וcoculture. לדוגמה, coculturing P. aeruginosa ו S. aureus על משטחים מוצקים אפשרה הדמיה של עיכוב צמיחה או שינויים בפנוטיפ המושבה, פיגמנט, או פוליסכרידייצור 14,15,16. מינים מעורבים biofilms, על משטחים ביוטיים או abiotic, כמו גם coculturing מינים חיידקיים בתרבות נוזלית גם אפשר מדידה של שינויים בצמיחה, חילוף החומרים, סובלנות לאנטיביוטיקה, תחרות וכדאיות, בנוסףלביטוי גנים וחלבון 17,18. בעוד ניסויי תרבות בתפזורת אלה חשפו תובנה כיצד P. aeruginosa ו S. aureus עשויים להשפיע אחד על השני בקנה מידה קהילתי, הם אינם מסוגלים לענות על שאלות חשובות על האינטראקציות המתקיימות ברמה של תא יחיד. השיטה המוצגת כאן מוסיפה לגישות לחקר אינטראקציות בין-מינים על ידי התמקדות בשינויים בתנועה, בכדאיות התא ובביטוי הגנים של תאים בודדים בתוך קהילה מקוטפת לאורך זמן.
אינטראקציות של תאים בודדים עשויות להיות שונות באופן נרחב מהאינטראקציות המתקיימות בקהילה בתפזורת של תאים. באמצעות ניתוח של תאים בודדים, ניתן לכמת הטרוגניות בתוך קהילה כדי ללמוד כיצד מיקום מרחבי של תאים משפיע על הדינמיקה הקהילתית או כיצד רמות ביטוי גנים וחלבונים משתנות בתוך חברים בודדים בקבוצה. תאי מעקב יכולים גם לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים בודדים נעים ומתנהגים לאורך זמן, דרך דורות מרובים. על ידי מעקב אחר תנועת תאים ושינויים בביטוי גנים בו זמנית, ניתן לבצע מתאם בין תנודות גנים ופנוטיפים מתאימים. פרוטוקולים קודמים לחקר מינים חיידקיים בודדים ברמת תא אחד תוארו. מחקרים אלה לנצל את תאי הדמיה חיים לאורך זמן במטוס אחד, היו שימושיים להתבוננות פנוטיפים כמו חלוקת תאיםורגישות אנטיביוטית 19,20. מיקרוסקופ הדמיה חיה נוספת נוצלה כדי לפקח על צמיחה, תנועה, קולוניזציה פני השטח היווצרות biofilm של מינים חיידקיים יחיד21,22,23. עם זאת, בעוד מחקרים אלה היו תובנה להבנת הפיזיולוגיה של חיידקים במונוקולטורה, ניסויים להתבוננות בהתנהגות חד-תאית של מינים חיידקיים מרובים לאורך זמן coculture מוגבלים.
כאן, פרוטוקולים קודמים המשמשים להדמיה חד-מינית הותאמו לאינטראקציות מחקר בין P. aeruginosa ו S. aureus. אורגניזמים אלה ניתן להבדיל תחת ניגודיות שלב בהתבסס על מורפולוגיות התא שלהם(P. aeruginosa הם bacilli ו S. aureus הם cocci). פיתוח שיטה זו אפשר לאחרונה את ההדמיה של התנהגויות תנועתיות שלא ייחסנו בעבר של P. aeruginosa בנוכחות S. aureus24. P. aeruginosa נמצא מסוגל לחוש S. aureus ממרחק ולהגיב עם תנועות מוגברות וכיוון תא יחיד כלפי אשכולות של S. aureus תאים. P. aeruginosa תנועה לכיוון S. aureus נמצא לדרוש את הסוג IV pili (TFP), תחזיות כמו שיער אשר הארכה מתואמת ונסיגה ליצור תנועה הנקראת תנועתיות עוויתות25.
מחקרים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו לחקר אינטראקציות קודמות בין מינים. עם זאת, הדמיה בצפיפות תאים גבוהה בנקודות זמן אינטראקציה מאוחרת יותר קשה בהתחשב בכך ששכבות בודדות של תאים כבר לא ניתן לזהות, אשר בעיקר מציב בעיות במהלך ניתוח שלאחר הדמיה. בהינתן מגבלה זו, השיטה מתאימה ביותר לאינטראקציות קודמות שניתן היה לעקוב אחריהן עם בדיקות מאקרו-סקופיות מסורתיות בצפיפות תאים גבוהה יותר המייצגות אינטראקציות מאוחרות יותר. מגבלות נוספות של שיטה זו כוללות את אופי התפוקה הנמוכה, שכן רק מדגם אחד ניתן למצוא בכל פעם ואת העלות של מיקרוסקופ, מצלמה, ותא סביבתי. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מהווה סיכונים לתאים חיידקיים כמו פוטוטוקסיסיטי ופוטו-בליבקינג, ולכן מגביל את התדירות שניתן לרכוש תמונות פלואורסצנטיות. לבסוף, רפידות agarose בשימוש בשיטה זו רגישים מאוד לשינויים בסביבה, מה שהופך אותו קריטי כדי לשלוט בתנאים כמו טמפרטורה ולחות, בהתחשב בכך רפידות יכול להתחיל להתכווץ או להרחיב אם התנאים אינם נכונים. לבסוף, בעוד שיטה זו אינה מחקה את הסביבה המארחת, היא מספקת רמזים כיצד מינים חיידקיים שונים מגיבים על משטחים, אשר ניתן לעקוב אחר בהם בתרופות שנועדו לחקות תנאים סביבתיים/מארחים.
שיטה זו שונה ממחקרים קודמים מעקב אחר תנועת תא יחיד, כי תאים מחוסנים בין כיסוי כרית agarose, הגבלת תאים אל פני השטח. הדבר מאפשר מעקב אחר תאים לאורך זמן במטוס יחיד; עם זאת, מגביל מחזורים של מעורבות משטח ארעי שנצפו כאשר תאים שקועים בנוזל26. יתרון נוסף של חיידקים הדמיה תחת כרית agarose הוא כי הוא מחקה את החיסון מבוסס צלחת מאקרוסקופית תת משטח אומר קלאסי משמש כדי לבחון P. aeruginosa עוויתותתנוענות 25. בהסכם זה, תאים חיידקיים מחוסנים בין החלק התחתון של צלחת פטרי ואת agar, שמירה על התאים במטוס אחד כפי שהם נעים על פני החלק התחתון של הצלחת כלפי חוץ מנקודת של חיסונים, ממש כמו פרוטוקול מיקרוסקופי זה.
פרוטוקול מיקרוסקופ זמן לשגות להדמיה אינטראקציות בין מינים המוצגים כאן מורכב 1) הכנת מדגם חיידקים וpad agarose, 2) בחירת הגדרות מיקרוסקופ עבור רכישת הדמיה 3) ניתוח שלאחר הדמיה. הדמיה מפורטת של תנועת תאים ומעקב יכולה להתבצע על ידי רכישת תמונות במרווחי זמן קצרים לפי ניגודיות שלב. מיקרוסקופ פלואורסץ יכול גם להיות מנוצל כדי לקבוע את הכדאיות של תאים או ביטוי גנים לאורך זמן. כאן, אנו מציגים דוגמה אחת של הסתגלות למיקרוסקופ פלואורסנצטי באמצעות תוספת של צבעי כדאיות רפידות agarose.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות המוצגות כאן מתארות פרוטוקול להדמיה של תאים חיים של אינטראקציות מינים חיידקיים ברמת תא יחיד עם שינויים עבור יישומים אחרים כולל מעקב אחר תאים וניטור הכדאיות של תאים. שיטה זו פותחת דרכים חדשות לחקר התנהגויות של תאים בודדים של מיקרואורגניזמים בcoculture עם מינים אחרים לאורך זמן. באופן ספצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן סיסטיק פיברוזיס Postdoc-to-Faculty מעבר פרס LIMOLI18F5 (DHL), סיסטיק פיברוזיס קרן גיוס סגל זוטר פרס LIMOLI19R3 (DHL), ו NIH T32 מענק הכשרה 5T32HL007638-34 (ASP). אנו מודים לג’פרי מייסנר, מינסו קים ואיתן גארנר על שיתוף פרוטוקולים ראשוניים וייעוץ להדמיה והכנת רפידות.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
