Кинетическая визуализация одноклеточных межвидовые бактериальные взаимодействия
Summary
Этот протокол визуализации живых бактериальных клеток позволяет визуализировать взаимодействия между несколькими бактериальными видами на одноклеточном уровне с течением времени. Промежуток времени визуализации позволяет для наблюдения каждого бактериального вида в монокультуре или кокультуры для допроса межвидовые взаимодействия в многовидовом бактериальных сообществ, в том числе отдельных клеток подвижности и жизнеспособности.
Abstract
Полимикробные сообщества широко распространены в природе, однако изучение их взаимодействия на одноклеточном уровне затруднено. Так, был разработан метод на основе микроскопии для наблюдения за межвидовыми взаимодействиями между двумя бактериальными патогенами. Здесь продемонстрировано использование этого метода для допроса взаимодействий между пестрым грам-отрицательным патогеном Pseudomonas aeruginosa и немостойким грамположительно-положительным патогеном, золотистым стафилококком. Этот протокол состоит из совместного инокуляции каждого вида между крышкой и агарозной площадкой, которая поддерживает клетки в одной плоскости и позволяет визуализировать бактериальное поведение как в пространстве, так и во времени.
Кроме того, продемонстрирована здесь промежуток времени микроскопия идеально подходит для визуализации ранних взаимодействий, которые происходят между двумя или более бактериальных видов, в том числе изменения в подвижности бактериальных видов в монокультуре и в совместной культуре с другими видами. Из-за характера ограниченного пространства образца в установке микроскопии, этот протокол менее применим для изучения более поздних взаимодействий между бактериальными видами, как только популяции клеток слишком высоки. Тем не менее, Есть несколько различных применений протокола, которые включают в себя использование окрашивания для визуализации живых и мертвых бактериальных клеток, количественная оценка гена или экспрессии белка через флуоресцентные репортеры, и отслеживание движения бактериальных клеток в обоих отдельных видов и многовидовых экспериментов.
Introduction
Полимикробные сообщества распространены в природе,охватывающих различные экологические 1,,2,,3 ичеловеческие ниши 4,,5. Некоторые из самых известных полимикробных инфекций в болезничеловека включают стоматологические биопленки 6,хронические раны 7,8, и респираторных инфекций у лиц с хроническойобструктивной болезнью легких 9, аппаратискусственной вентиляции легких пневмонии 10, и генетическое заболевание муковисцидоз (CF)11,12. Эти инфекции часто состоят из различных видов микробов; Однако в последнее время основное внимание уделяется взаимодействию между грамположительной бактерией Staphylococcus aureus и грам-отрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa. Исследования, в том числе пациентов coinfected с этими организмами и в пробирке анализы показывают, как конкурентные и совместные взаимодействия, которые могут иметь глубокое и неожиданное влияние на прогрессирование заболевания, микробное выживание, вирулентность, метаболизм, и антибиотик восприимчивость (подробно рассмотрены Hotterbeekx и др. 201713 и Лимоли и Хоффман 20193).
Растущий интерес к межвидовому взаимодействию во время инфекции дал различные методы для изучения поведения полимикробного сообщества. Как правило, эти исследования использовали пластины или бульон основе анализов для изучения фенотипических различий между монокультурой и кокультурой. Например, кокулирование P. aeruginosa и S. aureus на твердых поверхностях позволило визуализировать ингибирование роста или изменения в генотипе колонии, пигменте илипроизводстве полисахаридов 14,,15,,16. Смешанные виды биопленок, на биотических или абиотических поверхностях, а также coculturing бактериальных видов в жидкой культуре также позволило измерения изменений в росте, метаболизм, толерантность к антибиотикам, конкуренция и жизнеспособность, в дополнение к генной и белковойэкспрессии 17,18. Хотя эти массовые культурные эксперименты показали понимание того, как P. aeruginosa и S. aureus могут влиять друг на друга в масштабах сообщества, они не в состоянии ответить на важные вопросы о взаимодействиях, которые происходят на одноклеточном уровне. Представленный здесь метод дополняет подходы к изучению межвидовых взаимодействий, сосредоточив внимание на изменениях в движении, жизнеспособности клеток и экспрессии генов отдельных клеток в кокультурном сообществе с течением времени.
Одноклеточные взаимодействия могут сильно отличаться от взаимодействий, которые происходят в сообществе ячеек. С помощью одноклеточного анализа неоднородность в сообществе может быть количественно оценена для изучения того, как пространственное размещение клеток влияет на динамику сообщества или как уровни экспрессии генов и белков меняются в отдельных членах группы. Отслеживание ячеек может также дать представление о том, как одиночные клетки перемещаются и ведут себя с течением времени, через несколько поколений. Отслеживая движение клеток и изменения в экспрессии генов одновременно, можно сделать корреляцию между колебаниями генов и соответствующими фенотипами. Описаны предыдущие протоколы изучения отдельных видов бактерий на одноклеточном уровне. Эти исследования используют живые клетки изображения с течением времени в одной плоскости, и были полезны для наблюдения фенотипов, как делениеклеток и чувствительность к антибиотикам 19,20. Дополнительная живая микроскопия была использована для мониторинга роста, подвижности, колонизации поверхности и формирования биопленки отдельных бактериальныхвидов 21,,22,,23. Однако, в то время как эти исследования были проницательными для понимания физиологии бактерий в монокультуре, эксперименты по наблюдению одноклеточного поведения нескольких бактериальных видов с течением времени в кокультуре ограничены.
Здесь предыдущие протоколы, используемые для одно вида изображения были адаптированы для изучения взаимодействий между P. aeruginosa и S. aureus. Эти организмы могут быть дифференцированы в фазовом контрасте на основе их морфологии клеток(P. aeruginosa являются бациллы и S. aureus являются cocci). Разработка этого метода недавно позволила визуализировать ранее неописанные подвижности поведения P. aeruginosa в присутствии S. aureus24. Было установлено, что P. aeruginosa способен чувствовать S. aureus на расстоянии и реагировать с увеличением и направленной одноклеточных движений к скоплениям S. aureus клеток. P. aeruginosa движение в сторону S. aureus было установлено, требуют типа IV pili (TFP), волосы, как прогнозы, чьи скоординированные расширение и опровержение генерировать движение называется подергиванияподвижность 25.
Эти исследования демонстрируют полезность этого метода для допроса более ранних взаимодействий между видами. Тем не менее, визуализация при высокой плотности клеток в более поздних точках времени взаимодействия затруднена, учитывая, что одиночные слои клеток больше не могут быть идентифицированы, что в основном создает проблемы во время пост-изображения анализа. Учитывая это ограничение, метод лучше всего подходит для более ранних взаимодействий, которые затем могут сопровождаться традиционными макроскопическими анализами при более высокой плотности клеток, репрезентативными для более поздних взаимодействий. Дополнительные ограничения этого метода включают в себя низкую пропускную способность природы, так как только один образец может быть изображен в то время, и стоимость микроскопа, камеры и экологической камеры. Кроме того, флуоресцентная микроскопия создает риски для бактериальных клеток, таких как фототоксичность и фотопотливость, что ограничивает частоту флуоресценции изображения могут быть приобретены. Наконец, агарозные прокладки, используемые в этом методе, очень восприимчивы к изменениям в окружающей среде, что делает его критическим для контроля условий, таких как температура и влажность, учитывая, что колодки могут начать сокращаться или расширяться, если условия не являются правильными. Наконец, хотя этот метод не имитирует окружающую среду хозяина, он дает подсказки о том, как различные бактериальные виды реагируют на поверхностях, которые могут быть продолжены в анализах, предназначенных для имитации условий окружающей среды/хозяина.
Этот метод отличается от предыдущих исследований отслеживания одноклеточного движения, в том, что клетки прививаются между крышкой и агарозой площадку, ограничивая клетки на поверхность. Это позволяет отслеживать ячейки с течением времени в одной плоскости; однако, ограничивает циклы временного поверхностного взаимодействия наблюдается, когда клетки погружены в жидкость26. Дополнительным преимуществом изображений бактерий под агарозной площадкой является то, что она имитирует макроскопические пластины на основе подповерхно-поверхностных анализов прививки классически используется для изучения P. aeruginosa подергиванияподвижность 25. В этом анализе, бактериальные клетки прививаются между дном чашки Петри и агара, сохраняя клетки в одной плоскости, как они перемещаются по нижней части блюда наружу от точки прививки, так же, как этот протокол микроскопии.
Протокол замедленной микроскопии для визуализации межвидового взаимодействия, представленный здесь, состоит из 1) подготовки бактериального образца и агарозной площадки, 2) выбора параметров микроскопа для получения изображений и 3) поствизионного анализа. Детальная визуализация движения клеток и отслеживания может быть выполнена путем получения изображений с короткими временными интервалами путем фазового контраста. Микроскопия флуоресценции также может быть использована для определения жизнеспособности клеток или экспрессии генов с течением времени. Здесь мы покажем один пример адаптации к микроскопии флуоресценции за счет добавления красителей жизнеспособности к прокладкам агарозы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленные здесь методы описывают протокол для живоклеточной визуализации взаимодействий бактериальных видов на одноклеточном уровне с модификациями для других приложений, включая отслеживание клеток и мониторинг жизнеспособности клеток. Этот метод открывает новые возможност…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана финансированием от муковисцидоза Фонд Postdoc-к-факультету Переход премии LIMOLI18F5 (DHL), муковисцидоз Фонд junior Faculty Recruitment Award LIMOLI19R3 (DHL), и NIH T32 Учебный грант 5T32HL007638-34 (ASP). Мы благодарим Джеффри Мейснера, Минсу Кима и Итана Гарнера за обмен первоначальными протоколами и советами по визуализации и созданию колодок.
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
References
- Lamichhane, J. R., Venturi, V. Synergisms between microbial pathogens in plant disease complexes: a growing trend. Frontiers in Plant Science. 6, 385 (2015).
- Cursino, L., et al. Identification of an operon, Pil-Chp, that controls twitching motility and virulence in Xylella fastidiosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24 (10), 1198-1206 (2011).
- Limoli, D. H., Hoffman, L. R. Help, hinder, hide and harm: what can we learn from the interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus during respiratory infections. Thorax. 74, 684-692 (2019).
- Gabrilska, R. A., Rumbaugh, K. P. Biofilm models of polymicrobial infection. Future Microbiology. 10 (12), 1997-2015 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Microbial biofilms: e pluribus unum. Current Biology. 17 (10), 349-353 (2007).
- Marino, P. J., et al. Community analysis of dental plaque and endotracheal tube biofilms from mechanically ventilated patients. Journal of Critical Care. 39, 149-155 (2017).
- Frank, D. N., et al. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Repair and Regeneration. 17, 163-172 (2009).
- Fazli, M., et al. Nonrandom distribution of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in chronic wounds. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4084-4089 (2009).
- Shimizu, K., et al. Pathogens in COPD exacerbations identified by comprehensive real-time PCR plus older methods. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 10, 2009-2016 (2015).
- Behnia, M., Logan, S. C., Fallen, L., Catalano, P. Nosocomial and ventilator-associated pneumonia in a community hospital intensive care unit: a retrospective review and analysis. BMC Research Notes. 7, 232 (2014).
- Maliniak, M. L., Stecenko, A. A., McCarty, N. A. A longitudinal analysis of chronic MRSA and Pseudomonas aeruginosa co-infection in cystic fibrosis: a single-center study. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 350-356 (2016).
- Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 35 (6), 947-953 (2016).
- Hotterbeekx, A., Kumar-Singh, S., Goossens, H., Malhotra-Kumar, S. In vivo and in vitro interactions between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus spp. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7 (106), (2017).
- Smith, K., et al. Aspergillus fumigatus enhances elastase production in Pseudomonas aeruginosa co-cultures. Medical Mycology. 53, 645-655 (2015).
- Michelson, C. F., et al. Staphylococcus aureus alters growth activity, autolysis, and antibiotic tolerance in a human host-adapted Pseudomonas aeruginosa lineage. Journal of Bacteriology. 196 (22), 3903-3911 (2014).
- Ngamdee, W., et al. Competition between Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis. BMC Microbiology. 15, 56 (2015).
- Heir, E., Møretrø, T., Simessen, A., Langsrud, S. Listeria monocytogenes strains show larger variations in competitive growth in mixed culture biofilms and suspensions with bacteria from food processing environments. International Journal of Food Microbiology. 275, 46-55 (2018).
- Lutz, C., Thomas, T., Steinberg, P., Kjelleberg, S., Egan, S. Effect of interspecific competition on trait variation in Phaeobacter inhibens biofilms. Environmental Microbiology. 18 (5), 1635-1645 (2016).
- Meisner, J., et al. FtsEX is required for CwlO peptidoglycan hydrolase activity during cell wall elongation in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 89 (6), 1069-1083 (2013).
- Coates, J., et al. Antibiotic-induced population fluctuations and stochastic clearance of bacteria. eLife. 7, 32976 (2018).
- Korber, D. R., Lawrence, J. R., Sutton, B., Caldwell, D. E. Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens. Microbial Ecology. 18, 1-19 (1989).
- Lawrence, J. R., Korber, D. R., Caldwell, D. E. Behavioral analysis of Vibrio parahaemolyticus variants in high- and low- viscosity microenvironments by use of digital image processing. Journal of Bacteriology. 174 (17), 5732-5739 (1992).
- Lawrence, J. R., Wolfaardt, G. M., Korber, D. R. Determination of diffusion coefficients in biofilms by confocal laser microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 60 (4), 1166-1173 (1994).
- Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, 47365 (2019).
- Burrows, L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annual Review of Microbiology. 66 (1), 493-520 (2012).
- Lee, C. K., et al. Multigenerational memory and adaptive adhesion in early bacterial biofilm communities. PNAS. 115 (17), 4471-4476 (2018).
- Tolosa, A., et al. Enhanced field-of-view integral imaging display using multi-Köhler illumination. Optical Society of America. 22 (26), 31853-31863 (2014).
