एकल-सेल इंटरप्रीपी बैक्टीरियल इंटरैक्शन का गतिज दृश्य
Summary
यह लाइव-बैक्टीरियल सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल समय के साथ एकल-कोशिका स्तर पर कई बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच बातचीत के दृश्य के लिए अनुमति देता है। समय-चूक इमेजिंग मोनोकल्चर या कोकल्चर में प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों के अवलोकन के लिए व्यक्तिगत कोशिका गतिशीलता और व्यवहार्यता सहित बहुप्रजाति जीवाणु समुदायों में अंतरप्रजातियों की बातचीत से पूछताछ करने की अनुमति देता है।
Abstract
पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय प्रकृति में सर्वव्यापी हैं, फिर भी एकल कोशिका स्तर पर उनकी बातचीत का अध्ययन करना मुश्किल है। इस प्रकार, दो जीवाणु रोगजनकों के बीच अंतरप्रजातियों की बातचीत को देखने के लिए एक माइक्रोस्कोपी-आधारित विधि विकसित की गई है। एक मोटिवल ग्राम-नकारात्मक रोगजनक, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और एक गैर-मोटिवल ग्राम-पॉजिटिव रोगजनक, स्टेफिलोकोकस ऑरियस के बीच बातचीत से पूछताछ करने के लिए इस विधि का उपयोग यहां प्रदर्शित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में एक कवरस्लिप और एक एगर उठे पैड के बीच प्रत्येक प्रजाति को सह-अनुमानित किया जाता है, जो कोशिकाओं को एक ही विमान में बनाए रखता है और अंतरिक्ष और समय दोनों में बैक्टीरियल व्यवहार के दृश्य के लिए अनुमति देता है।
इसके अलावा, यहां प्रदर्शित समय-चूक माइक्रोस्कोपी दो या दो से अधिक जीवाणु प्रजातियों के बीच होने वाली शुरुआती बातचीत की कल्पना करने के लिए आदर्श है, जिसमें मोनोकल्चर में बैक्टीरियल प्रजातियों में परिवर्तन और अन्य प्रजातियों के साथ सहसंस्कृति में परिवर्तन शामिल हैं। माइक्रोस्कोपी सेटअप में सीमित नमूना स्थान की प्रकृति के कारण, यह प्रोटोकॉल कोशिका आबादी बहुत अधिक होने के बाद बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच बाद में बातचीत का अध्ययन करने के लिए कम लागू होता है। हालांकि, प्रोटोकॉल के कई अलग-अलग अनुप्रयोग हैं जिनमें इमेजिंग लाइव और मृत बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए धुंधला का उपयोग, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के माध्यम से जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा, और दोनों एकल प्रजातियों और बहुप्रजातियों के प्रयोगों में बैक्टीरियल सेल आंदोलन पर नज़र ें चढ़ाई शामिल है।
Introduction
पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय प्रकृति में आम हैं, जो विभिन्न प्रकार के पर्यावरण1,,2,,3 और मानव निकस4,,5 में फैलेहुएहैं। मानव रोग में कुछ सबसे कुख्यात पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमणों में दंत बायोफिल्म्स6,पुराने घाव7,,8,और क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज9,वेंटिलेटर से जुड़े निमोनिया10और जेनेटिक डिजीज सिस्टिक फाइब्रोसिस(सीएफ) 11,,12वाले व्यक्तियों में श्वसन संक्रमण शामिल हैं । ये संक्रमण अक्सर विविध माइक्रोबियल प्रजातियों से बने होते हैं; हालांकि, ग्राम-सकारात्मक जीवाणु स्टेफिलोकोकस ऑरियस और ग्राम-नकारात्मक जीवाणु स्यूडोमोनास एरुगिनोसा के बीच बातचीत पर हाल ही में ध्यान केंद्रित किया गया है। इन जीवों और इन विट्रो विश्लेषणों से संक्रमित रोगियों सहित अध्ययनों से प्रतिस्पर्धी और सहयोगात्मक दोनों तरह की बातचीत का पता चलता है जो रोग प्रगति, माइक्रोबियल अस्तित्व, उग्रता, चयापचय और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता पर गहरा और अप्रत्याशित प्रभाव डाल सकते हैं (Hotterbeekx et al. 201713 और लिमोली और हॉफमैन 20193)द्वारा विस्तार से समीक्षा की गई है।
संक्रमण के दौरान अंतरप्रजाति इंटरैक्शन में बढ़ती रुचि पॉलीमाइक्रोबियल समुदाय व्यवहार का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तरीकों से मिली है। आमतौर पर, इन अध्ययनों ने मोनोकल्चर और कोकल्चर के बीच फेनोटाइपिक मतभेदों की जांच करने के लिए प्लेट या शोरबा-आधारित परख का उपयोग किया है। उदाहरण के लिए, ठोस सतहों पर पी एरुगिनोसा और एस ऑरियस को कॉलोनी फेनोटाइप, वर्णक, या पॉलीसैकराइड,उत्पादन,14, 15,16में विकास अवरोध या परिवर्तनों के दृश्य के लिए अनुमति दी गई है।16 जैवटिक या अजैविक सतहों पर मिश्रित प्रजातियों बायोफिल्म्स, साथ ही तरल संस्कृति में बैक्टीरियल प्रजातियों को भी जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति17, 18,18के अलावा विकास, चयापचय, एंटीबायोटिक सहिष्णुता, प्रतिस्पर्धा और व्यवहार्यता में परिवर्तन का मापन सक्षम है। हालांकि इन थोक संस्कृति प्रयोगों में अंतर्दृष्टि से पता चला है कि कैसे पी aeruginosa और एस ऑरियस समुदाय पैमाने पर एक दूसरे को प्रभावित कर सकता है, वे बातचीत है कि एकल सेल स्तर पर जगह लेने के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में असमर्थ हैं । यहां प्रस्तुत विधि समय के साथ एक सहसंस्कृत समुदाय के भीतर आंदोलन, कोशिका व्यवहार्यता, और एकल कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करके अंतरप्रजातियों बातचीत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण को जोड़ती है ।
एकल-कोशिका इंटरैक्शन कोशिकाओं के थोक समुदाय में होने वाली बातचीत से व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं। एकल कोशिका विश्लेषण के माध्यम से, एक समुदाय के भीतर विषमता का अध्ययन करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है कि कोशिकाओं की स्थानिक नियुक्ति समुदाय की गतिशीलता को कैसे प्रभावित करती है या समूह के व्यक्तिगत सदस्यों के भीतर जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर कैसे बदलता है। ट्रैकिंग कोशिकाएं कई पीढ़ियों के माध्यम से एक कोशिकाओं को समय के साथ कैसे आगे बढ़ाती हैं और व्यवहार करती हैं, इस बारे में भी जानकारी प्रदान कर सकती हैं। सेल आंदोलन और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन समवर्ती ट्रैकिंग द्वारा, सहसंबंध जीन उतार चढ़ाव और इसी फेनोटाइप के बीच किया जा सकता है । एकल कोशिका स्तर पर व्यक्तिगत जीवाणु प्रजातियों का अध्ययन करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । ये अध्ययन एक ही विमान में समय के साथ लाइव इमेजिंग कोशिकाओं का लाभ उठाते हैं, और सेल डिवीजन और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता19,,20जैसे फेनोटाइप को देखने के लिए उपयोगी रहे हैं। एकल जीवाणु प्रजातियों21, 22, 23,22,23के विकास, गतिशीलता, सतह उपनिवेशीकरण और बायोफिल्म गठन की निगरानी के लिए अतिरिक्त लाइव-इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया है। हालांकि, जबकि इन अध्ययनों मोनोकल्चर में बैक्टीरिया के शरीर विज्ञान को समझने के लिए व्यावहारिक किया गया है, coculture में समय के साथ कई जीवाणु प्रजातियों के एकल सेल व्यवहार देखने के लिए प्रयोग सीमित हैं ।
यहां, एकल प्रजातियों इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पिछले प्रोटोकॉल को पी एरुगिनोसा और एस ऑरियसके बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। इन जीवों को उनके सेल मॉर्फोलोजी के आधार पर चरण विपरीत के तहत विभेदित किया जासकता है (पी एरुगिनोसा बैसिली हैं और एस ऑरियस कोसीआई हैं)। इस विधि के विकास ने हाल ही में एस ऑरियस24की उपस्थिति में पी एरुगिनोसा के पहले से वर्णित गतिशीलता व्यवहारों के दृश्य को सक्षम किया । पी एरुगिनोसा को दूरी से एस ऑरियस को संवेदन करने और एस ऑरियस कोशिकाओं के समूहों की ओर वृद्धि और दिशात्मक एकल कोशिका आंदोलनों के साथ प्रतिक्रिया करने में सक्षम पाया गया था । एस ऑरियस की ओर पी एरुगिनोसा आंदोलन को टाइप IV पिली (टीएफपी), बालों जैसे अनुमानों की आवश्यकता पाई गई, जिनके समन्वित विस्तार और रिऐक्शन एक आंदोलन उत्पन्न करते हैं जिसे हिल मोटिविटी25कहा जाता है।
ये अध्ययन प्रजातियों के बीच पहले की बातचीत से पूछताछ के लिए इस विधि की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं। हालांकि, बाद में बातचीत के समय बिंदुओं पर उच्च सेल घनत्व पर इमेजिंग मुश्किल है कि कोशिकाओं की एकल परतों की पहचान नहीं की जा सकती है, जो ज्यादातर पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण के दौरान मुद्दे बन जाती हैं। इस सीमा को देखते हुए, विधि पहले की बातचीत के लिए सबसे उपयुक्त है जिसे बाद में बातचीत के उच्च सेल घनत्व प्रतिनिधि पर पारंपरिक स्थूल परख के साथ पालन किया जा सकता है। इस विधि की अतिरिक्त सीमाओं में कम थ्रूपुट प्रकृति शामिल है, क्योंकि एक समय में केवल एक नमूना इमेज किया जा सकता है और माइक्रोस्कोप, कैमरा और पर्यावरणीय कक्ष की लागत। इसके अलावा, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी फोटोटॉक्सीसिटी और फोटोब्लैचिंग जैसी बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए जोखिम बन गया है, इसलिए आवृत्ति को सीमित किया जा सकता है जो फ्लोरेसेंस छवियों का अधिग्रहण किया जा सकता है। अंत में, इस विधि में उपयोग किए जाने वाले एग्राजिंग पैड पर्यावरण में परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जिससे तापमान और आर्द्रता जैसी स्थितियों के लिए नियंत्रण करना महत्वपूर्ण होता है, यह देखते हुए कि यदि स्थितियां सही नहीं हैं तो पैड हटना या विस्तार करना शुरू कर सकते हैं। अंत में, जबकि इस विधि मेजबान पर्यावरण की नकल नहीं करता है, यह कैसे अलग जीवाणु प्रजातियों सतहों पर प्रतिक्रिया के लिए सुराग प्रदान करता है, जो पर्यावरण की नकल करने के लिए डिज़ाइन की गई परख में पीछा किया जा सकता है/
यह विधि एकल-कोशिका आंदोलन को ट्रैक करने वाले पिछले अध्ययनों से अलग है, जिसमें कोशिकाओं को कवरस्लिप और एगरेज़ पैड के बीच टीका लगाया जाता है, जो कोशिकाओं को सतह पर सीमित करता है। यह एक ही विमान में समय के साथ सेल ट्रैकिंग सक्षम बनाता है; हालांकि, सीमा क्षणिक सतह सगाई के चक्र मनाया जब कोशिकाओं तरल26में डूबे हुए हैं . एक agarose पैड के तहत इमेजिंग बैक्टीरिया का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह स्थूल प्लेट आधारित उप सतह टीका परख की नकल करता है शास्त्रीय पी aeruginosa हिल गतिशीलता25की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया । इस परख में, जीवाणु कोशिकाओं को पेट्री डिश और एगर के नीचे के बीच टीका लगाया जाता है, कोशिकाओं को एक ही विमान में रखते हुए, क्योंकि वे टीका के बिंदु से बाहर की ओर पकवान के नीचे की ओर बढ़ते हैं, इस माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल की तरह।
यहां प्रस्तुत अंतरप्रजाति इंटरैक्शन की कल्पना के लिए समय-चूक माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल में 1) बैक्टीरियल नमूना तैयार करना और एगर उठे पैड, 2) इमेजिंग अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का चयन करना और 3) पोस्ट-इमेजिंग विश्लेषण शामिल है। सेल आंदोलन और ट्रैकिंग का विस्तृत दृश्य चरण विपरीत द्वारा कम समय अंतराल पर छवियों के अधिग्रहण द्वारा किया जा सकता है। समय के साथ सेल व्यवहार्यता या जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का भी उपयोग किया जा सकता है। यहां, हम एग्राजिंग पैड में व्यवहार्यता रंगों के अलावा फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए अनुकूलन का एक उदाहरण दिखाते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों में सेल ट्रैकिंग और निगरानी सेल व्यवहार्यता सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए संशोधनों के साथ एकल-सेल स्तर पर बैक्टीरियल प्रजातियों की बातचीत के लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एक प्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन पोस्टडॉक-टू-फैकल्टी ट्रांजिशन अवार्ड लिमोली18एफ5 (डीएचएल), सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन जूनियर फैकल्टी रिक्रूटमेंट अवार्ड लिमोली19आर3 (डीएचएल) और एनआईएच टी32 ट्रेनिंग ग्रांट 5T32एच007638-34 (एएसपी) से फंडिंग द्वारा सपोर्ट किया गया । हम जेफरी Meisner, मिंसु किम, और एसे गार्नर इमेजिंग और पैड बनाने के लिए प्रारंभिक प्रोटोकॉल और सलाह साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Agarose pads | |||
| 35 mm Glass Bottom Dish with 20 mm Micro-well #1.5 Cover Glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | One for agarose pad molds, one for experiment |
| KimWipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666A | |
| Low-Melt Agarose | Nu-Sieve GTG/Lonza | 50081 | For making agarose pads |
| Round-Bottom Spatulas | VWR | 82027-492 | |
| Round-Tapered Spatulas | VWR | 82027-530 | |
| Silicon Isolators, Press-to-Seal, 1 well, D diameter 2.0 mm 20 mm, silicone/adhesive | Sigma-Aldrich | S6685-25EA | For agarose pad molds |
| Sterile Petri Plates, 85 mm | Kord-Valmark /sold by RPI | 2900 | |
| Tweezers | VWR | 89259-944 | |
| M8T Minimal Media | |||
| D (+) Glucose | RPI | G32045 | |
| KH2PO4 | RPI | P250500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 208094 | |
| NaCl | RPI | S23025 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| Microscope | |||
| Andor Sona 4.2B-11 | Andor | 77026135 | Camera. 4.2 Megapixel Back-illuminated sCMOS, 11 μm pixel, 95% QE, 48 fps, USB 3.0, F-mount. |
| Filter Cube GFP | Nikon | 96372 | Filter cube |
| Filter Cube TxRed | Nikon | 96375 | Filter cube |
| H201-NIKON-TI-S-ER | Okolab | 77057447 | Stagetop incubator |
| Nikon NIS-Elements AR with GA3 and 2D and 3D tracking | Nikon | 77010609, MQS43110, 77010603, MQS42950 | Software for data analysis |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Model Ti2-E | Microscope |
| CFI Plan Apo ƛ20x objective (0.75NA) | Nikon | MRD00205 | Objective |
| CFI Plan Apo ƛ100x oil Ph3 DM objective (1.45NA) | Nikon | MRD31905 | Objective |
| ThermoBox with built-in fan heaters | Tokai Hit | TI2TB-E-BK | Enclosure |
| Bacterial Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) | PMID: 7604262 | Non-mucoid prototroph | |
| Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP) | PMID: 9361441 | ||
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 (WT) pPrpoD-mKate2 | PMID: 26041805 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) | PMID: 23404398 | USA300 CA-Methicillin resistant strain LAC without plasmids | |
| Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT) pCM29 (sarAP1-sGFP) | PMID: 20829608 | ||
| Staphylococcus aureus USA300 LAC △agrBDCA | PMID: 31713513 | ||
| Viability Stain | |||
| Propidium Iodide | Invitrogen | L7012 | LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit |
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