الكمية في الوقت الحقيقي PCR التقييم من التعبيرات ميكرورنا في الكلى الماوس مع انسداد الحالب أحادي
Summary
نحن وصف طريقة لتقييم التعبير ميكرورنا في الكلى من الفئران مع انسداد الحالب الأحادي (UUO) عن طريق تفاعل البوليميراز سلسلة النسخ العكسي الكمية. هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة ملامح التعبير ميكرورنا الكلي في الفئران مع UUO وفي سياق الحالات المرضية الأخرى.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) هي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، غير ترميز RNA الجزيئات التي تنظم عادة التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ من خلال ربط لمواقع مستهدفة مكملة جزئيا في المنطقة غير المترجمة 3 ‘(UTR) من RNA رسول (مرنا)، مما يقلل من ترجمة الرنا والاستقرار. وقد تم التحقيق في ملامح التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة من الفئران، ولكن لم تكن متاحة الأساليب القياسية لتنقية وكمية من ميرنا في الكلى الماوس. لقد أنشأنا طريقة فعالة وموثوق بها لاستخراج وتقييم التعبير ميرنا في الكلى الماوس مع التليف الخلالي الكلوي بواسطة تفاعل البوليمرات العكسية الكمية (qRT-PCR). وتطلب البروتوكول خمس خطوات: (1) إنشاء فئران العرقلة الحالبية الصورية والأحادية؛ (2) و(ج) إنشاء فئران للإعاقة الحالبانية من جانب واحد؛ (2) إنشاء فئران من نوعها؛ (2) إنشاء فئران للإعاقة الشرجية واللحالية من جانب واحد؛ (2 (2) استخراج عينات من الكلى من الفئران UUO؛ (3) استخراج RNA الكلي، الذي يشمل ميرنا، من عينات الكلى؛ (4) مكملة الحمض النووي (cDNA) التوليف مع النسخ العكسي من ميرنا؛ و (5) qRT-PCR باستخدام cDNA. باستخدام هذا البروتوكول، أكدنا بنجاح أنه بالمقارنة مع الضوابط، تم زيادة التعبير عن ميرنا-3070-3p بشكل كبير وتلك من ميرنا-7218-5p وميرنا-7219-5p انخفضت بشكل كبير في الكلى نموذج الماوس من التليف الخلالي الكلوي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد التعبير ميرنا في كليتي الفئران مع UUO.
Introduction
MicroRNAs (ميرناس) – RNAs قصيرة وغير متكول التي تسبب التدهور والتثبيط النسخي من رسول RNA (مرنا)1 – وقد ثبت لتنظيم التعبير عن مختلف mRNAs التي لها أدوار حاسمة في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض (مثل، التهاب، التليف، الاضطرابات الأيضية، والسرطان). قد يكون بعض من miRNAs المرشحة المؤشرات الحيوية رواية والأهداف العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض2,3,4,5. على الرغم من أن ميرنا لمحات التعبير في أجهزة الماوس والأنسجة بما في ذلك الدماغ والقلب والرئة والكبد والكلى وقد وصفت6,7,8,9,10, لم تكن هناك طرق قياسية لاستخراج وتقييم ميرناس في الماوس الكلى مع التليف الخلالي الكلوي.
لقد صممنا بروتوكولا لتنقية موثوق بها والكشف عن تعبيرات miRNAs في كلى الفئران مع التليف الخلالي الكلوي. ويتضمن البروتوكول خمس خطوات رئيسية، على النحو التالي. (1) 8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور تنقسم إلى مجموعات من الفئران التي تخضع لعملية صورية (الضوابط) والفئران التي تتعرض لعملية جراحية توفير انسداد الحالب الأحادي (UUO)، والتي ترتبط التليف الخلالي الكلوي. (2) يتم استخراج عينات الكلى من الفئران صورية وUUO ، متجانسة بشكل منفصل في التجانس السيليكون ، ومن ثم نقلها إلى نظام تمزيق biopolymer على العمود تدور microcentrifuge11،12. (3) يتم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ميرنا من عينات الكلى بواسطة عمود تدور السيليكا القائم علىغشاء 12،13. (4) باستخدام هذا RNA مجموع المستخرج، يتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من RNA مجموع مع استخدام النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي14،15. (5) يتم تقييم تعبيرات miRNAs بواسطة الكمى عكس النسخ البوليمرات سلسلة تفاعل (qRT-PCR) باستخدام صبغة intercalating14،15.
ويستند هذا البروتوكول على التحقيقات التي حصلت على عمليات استخراج ذات مغزى وتقييمات من miRNAs في مجموعة متنوعة من الأنسجة11,12,13,14,15, ونظام biopolymer التقطيع المستخدمة في البروتوكول وقد تبين لتنقية عالية الجودة, مجموع RNA من الأنسجة في 200612. وبالإضافة إلى ذلك، أكدت الدراسات السابقة دقة وحساسية جوانب من البروتوكول (أي، التوليف cDNA مع النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي من RNA مجموع المستخرجة) لتحديد التعبير ميرنا بواسطة qRT-PCR مع صبغة14،15intercalating . وبما أن البروتوكول الجديد يتمتع بمزايا البساطة وتوفير الوقت والحد من الأخطاء التقنية ، يمكن استخدام البروتوكول في الأبحاث التي تتطلب تحديد دقيق وحساس لملف ميرنا في الكلى الماوس. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على التحقيقات في العديد من الحالات المرضية.
نحن بعد ذلك وصف تحديد ملامح التعبير ميرنا في الفئران مع UUO، والذي يرتبط التليف الخلالي الكلوي. في البشر، والتليف الخلالي الكلوي هو سمة مشتركة وهامة لكل من أمراض الكلى المزمنة ونهاية المرحلة مرض الكلى، بغض النظر عن المسببات16،17. ويرتبط هذا التليف الخلالي الكلوي مع تطور الفشل الكلوي، ويتميز بزيادة التعبيرات من مكونات مصفوفة خارج الخلية في المساحات الخلالية (على سبيل المثال، الكولاجين، فيبرومينكتين، والعضلات α على نحو سلس actin)17،18.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف أعلاه مع qRT-PCR بنجاح تحديد مستويات التعبير من miRNAs المستهدفة. تقييم miRNAs المستخرجة مهم عند السعي للحصول على بيانات ذات مغزى qRT-PCR، ومن أجل تأكيد جودة miRNAs قبل تنفيذ qRT-PCR، ينبغي فحص نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومتر مع مقياس الطيفي. إذا لم يكن بالإمكان الحصول على …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ميشيل جودي، دكتوراه، من مجموعة إدانز (https://en-author-services.edanzgroup.com/) لتحرير مسودة لهذه المخطوطة.
Materials
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. Pathogenesis of liver cirrhosis. World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
