अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स आधारित और अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स-मुरीन वृषण ऑर्गेनॉइड की मुक्त पीढ़ी
Summary
यहां, प्राथमिक नवजात मुरीन वृषण कोशिकाओं से वृषण ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए चार तरीकों का वर्णन किया गया है यानी, एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और ईसीएम-फ्री 2डी और 3डी कल्चर वातावरण । इन तकनीकों में कई शोध अनुप्रयोग हैं और विट्रो में वृषण विकास और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं।
Abstract
वृषण ऑर्गेनॉइड विट्रो में वृषण विकास, शुक्राणुओं की कैंसर और एंडोक्राइनोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करते हैं। वृषण ऑर्गेनॉइड बनाने के लिए कई तरीके विकसित किए गए हैं। इनमें से कई विधियां डी नोवो ऊतक असेंबली को बढ़ावा देने के लिए एक्सपेरिमेंटल मैट्रिक्स (ईसीएम) पर भरोसा करती हैं, हालांकि, बायोमिमेटिक आकृति विज्ञान और ऊतकों के कार्य के संदर्भ में तरीकों के बीच अंतर हैं। इसके अलावा, प्रकाशित तरीकों की कुछ सीधी तुलनाएं हैं। यहां, ऑर्गेनॉइड जनरेशन प्रोटोकॉल में अंतर का अध्ययन करके एक सीधी तुलना की जाती है, जिसमें परिणाम दिए जाते हैं। चार ठेठ पीढ़ी के तरीके: (1) 2D ECM मुक्त, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM मुक्त, और (4) 3 डी ईसीएम संस्कृति का वर्णन किया गया है । वृषण ऑर्गेनॉइड उत्पादन का आकलन करने के लिए तीन प्राथमिक बेंचमार्क का उपयोग किया गया था। ये सेलुलर आत्म-असेंबली, प्रमुख सेल प्रकारों (सेर्टोली, लेडिग, रोगाणु और पेरिट्यूबुलर कोशिकाओं) को शामिल करना, और उचित रूप से विभाजित ऊतक वास्तुकला है। परीक्षण किए गए चार वातावरणों में से, 2D ईसीएम और 3 डी ईसीएम-मुक्त संस्कृतियों ने देशी टेस्ट के समान आंतरिक मॉर्फोलोजी के साथ ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए, जिसमें ट्यूबलर बनाम इंटरस्टिशियल सेल प्रकारों का डी नोवो कंपार्टमेंटलाइजेशन, ट्यूबल जैसी संरचनाओं का विकास और एक स्थापित दीर्घकालिक अंतकालीन कार्य शामिल है। सभी तरीकों का अध्ययन किया unsorted, प्राथमिक murine वृषण सेल निलंबन और आमतौर पर सुलभ संस्कृति संसाधनों का इस्तेमाल किया । ये वृषण ऑर्गेनॉइड जनरेशन तकनीकें विट्रो में वृषण ऑर्गेनोजेनेसिस और फिजियोलॉजी में अनुसंधान पहलों के लिए एक अत्यधिक सुलभ और प्रजनन योग्य टूलकिट प्रदान करती हैं।
Introduction
वृषण ऑर्गेनॉइड विट्रो1,,2,,3,,4में वृषण विकास, शुक्राणुओं की कैंसर और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक अग्रणी तकनीक है। ऑर्गेनॉइड उत्पादन के लिए कई तरीकों का पता लगाया गया है; इनमें दो आयामी (2D) और त्रि-आयामी (3 डी) झुकाव दोनों में विभिन्न प्रकार के एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) और ईसीएम-मुक्त संस्कृति प्रणालियां शामिल हैं। विभिन्न पीढ़ी के तरीके अलग सेलुलर असेंबली रणनीतियों को बढ़ावा दे सकते हैं; इसके परिणामस्वरूप प्रकाशित ऑर्गेनॉइड मॉडल के बीच उच्च स्तर का रूपात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनशीलता होती है। इस लेख का उद्देश्य इन विट्रो वृषण मॉडल की वर्तमान स्थिति पर चर्चा करना है, और वृषण ऑर्गेनॉइड प्रयोगों को डिजाइन करते समय भविष्य के जांचकर्ताओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम करना है। वर्तमान अध्ययन के भीतर, चार अलग-अलग संस्कृति प्रणाली के आदर्शों को परिभाषित किया गया है और प्रायोगिक प्रक्रिया और जैविक परिणाम में विशेषता है। इनमें शामिल हैं: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, और 3D ECM संस्कृति विधियां। यहां प्रस्तुत रणनीतियों का उद्देश्य विभिन्न प्रयोगशालाओं और अनुसंधान समूहों के बीच सरल, सुलभ और अत्यधिक प्रजनन योग्य होना है।
ऐतिहासिक रूप से टेस्टिस के लिए, पदनाम “इन विट्रो”, वृषण ऊतकों और कोशिकाओं के कई अलग-अलग संस्कृति विधियों के लिए उपयोग किया गया है। इनमें ऑर्गेनोटिपिक टिश्यू/ऑर्गन कल्चर मेथड्स(यानीएक्सप्लांट कल्चर) 5, अलग-अलग सेमिनिफेरस ट्यूबल कल्चर6,टेस्टिकुलर सेल कल्चर7और डी नोवो टिश्यू मॉर्फोजेनेसिस (यानी बायोलॉजिकल स्ट्रेंट्स एंड ऑर्गेनॉइड)केतरीके शामिल हैं । इन विट्रो स्पर्मेटोजेनेसिस की पहली जांच लगभग 100 साल पहले की गई थी, जिसमें खरगोश टेस्टिस एक्सप्लांट की संस्कृति 1 9 208में और बाद में 1 9 37 में माउस एक्सप्लांट9के साथ हुई थी। इन प्रारंभिक प्रयोगों के भीतर शुक्राणुओं को संस्कृति के पहले सप्ताह में काफी हद तक पतित करने के लिए मनाया गया था, हालांकि कुछ meiotically अंतर कोशिकाओं की पहचान की गई थी । इन ऐतिहासिक रिपोर्टों की याद ताजा करते हुए, टेस्टिस एक्सप्लांट संस्कृति को पुनर्जीवित किया गया और 2011 में अनुकूलित किया गया ताकि टेस्टिस10का अध्ययन करने के लिए एक व्यवहार्य तकनीक बन सके। वर्ष 2011 से, एक्सप्लांट संस्कृति ने कईरिपोर्टों 11 , 12,,1313में प्रजनन सक्षम शुक्राणु का उत्पादन किया है। फिर भी, पहले से मौजूद देशी टेस्टिस ट्यूबल पर एक्सप्लांट संस्कृति की निर्भरता के कारण, इन हालिया अग्रिमों को “पूर्व वीवो” वृषण समारोह और शुक्राणुओं के उदाहरणों के रूप में अधिक सटीक रूप से वर्णित किया गया है, ऊतक समारोह जिसे किसी जीव के शरीर से हटाने पर बनाए रखा गया था या फिर से शुरू किया गया था। साहित्य में इसकी व्यापकता के बावजूद, वृषण विस्तार के भीतर दीर्घकालिक रोगाणु कोशिका,रखरखाव और भेदभाव14, 15, 16,,1517,,18को दोहराने के लिए चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से समय सीमा के साथ पूरी तरह से विट्रो शुक्राणुओं में निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त (मनुष्यों में चूहों में ~ 35 दिन19 और 74 मनुष्यों में20)।,18 यह सराहना करते है कि एक ही चुनौतियों के कई १०० साल पहले अनुभवी पेचीदा है, आज भी पूर्व वीवो शुक्राणुओं के भीतर अनुभव कर रहे हैं ।
पूर्व वीवो दृष्टिकोणों से अलग, वृषण ऑर्गेनॉइड डी नोवो असेंबल माइक्रोटिस्यूस हैं जो पूरी तरह से सेलुलर स्रोतों (यानी प्राथमिक वृषण कोशिकाओं) से विट्रो में उत्पन्न होते हैं। वृषण ऑर्गेनॉइड पहले से मौजूद देशी ऊतक पर क्षेत्र की ऐतिहासिक निर्भरता को दरकिनार करने और विट्रो में पूरी तरह से वृषण जीव विज्ञान को फिर से काटना करने के लिए एक रचनात्मक रणनीति प्रदान करते हैं। अधिकांश ऑर्गेनॉइड ऊतक मॉडल द्वारा साझा की गई कई आवश्यकताएं हैं; इनमें (1) वीवो-मिमेटिक ऊतक आकृति विज्ञान या वास्तुकला में, (2) प्रतिनिधित्व ऊतक के कई प्रमुख सेल प्रकार, (3) स्व-असेंबली या स्व-संगठन अपनी पीढ़ी में, और (4) प्रतिनिधित्व ऊतक के कार्य और शरीर विज्ञान के,कुछ स्तर21,22, 23,,,24।23 टेस्टिस के लिए, इसे चार प्रमुख हॉलमार्क में कैप्चर किया जा सकता है: (1) प्रमुख वृषण कोशिका प्रकारों को शामिल करना, रोगाणु, सेर्टोली, लेडिग, पेरिटुब्यूबुलर, और अन्य इंटरस्टिशियल कोशिकाएं, (2) सेल-निर्देशित ऊतक असेंबली, (3) उचित रूप से विभाजित कोशिका प्रकारों को अलग ट्यूबलर डिब्बों (रोगाणु और सेर्टोली) और इंटरस्टिशियल क्षेत्रों (अन्य सभी सेल प्रकार) में, और (4) ऊतक समारोह की कुछ डिग्री (जैसे, प्रजनन हार्मोन गुप्त या ऊतक प्रतिक्रियाएं, और रोगाणु सेल और प्रजनन और प्रजनन रोगाणु कोशिका भेदभाव पूर्व वीवो और विट्रो में बनाए रखने में ऐतिहासिक चुनौतियों को ध्यान में रखते हुए, वीवो-मिमेटिक वृषण वास्तुकला (यानी, सेमिनिफेरस ट्यूबुल्स जैसी संरचनाएं) में अतिरिक्त मार्कर के साथ वृषण फिजियोलॉजी (जैसे, एंडोक्राइन फ़ंक्शन) के अनुकरण का सुझाव देने वाले लक्षणों को प्राथमिकता दी जाती है जो एक दिन विट्रो शुक्राणुओं में बनाए रख सकते हैं।
अधिकांश प्रकाशित वृषण ऑर्गेनॉइड विधियां व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईसीएम (जैसे, कोलेजन या मालिकाना ईसीएम फॉर्मूलेशन)25,26, 27या कस्टम-सोर्स ईसीएम,(यानी, डिसेल्यूलराइज्ड टेस्टिस ईसीएम-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल),28,29,,30का लाभ उठाते हैं।, एक्सोजेनस ईसीएम ऊतक पीढ़ी के लिए एक असेंबली-सहायक पाड़ प्रदान करने के माध्यम से डी नोवो ऊतक गठन को बढ़ावा देता है। ईसीएम विधियों ने ऊतक गठन का एक प्रभावशाली स्तर प्रदान किया है, जिसमें कुछ रोगाणु कोशिका उपस्थिति और ऊतक-मिमेटिक आकृति विज्ञान25,,28शामिल हैं। हालांकि, वे जिन ईसीएमएस का उपयोग करते हैं, वे हमेशा सार्वभौमिक रूप से उपलब्ध नहीं होते हैं (यानी, डीसेलुलराइज्ड ईसीएम-व्युत्पन्न हाइड्रोगेल), और कुछ तरीकों के लिए परिष्कृत जेल और सेल सीडिंग झुकाव (जैसे, ईसीएम और 3 डी प्रिंटिंग के 3-लेयर ग्रेडिएंट)25,31,,32की आवश्यकता होती है।, पाड़ मुक्त तरीकों (उदाहरण के लिए, हैंगिंग ड्रॉप और नॉनहेडेरेंट कल्चर प्लेट्स)33,,34,,35 ने ईसीएम जैल या मचान की आवश्यकता के बिना मजबूत और अत्यधिक प्रजनन योग्य ऑर्गेनॉइड भी उत्पन्न किए हैं। हालांकि, इन पाड़-मुक्त ऑर्गेनॉइड की ऊतक आकृति विज्ञान अक्सर वीवो टेस्ट में भिन्न होती है, और इनमें से अधिकांश रिपोर्टों में ऊतकगठन 33, 34, 36,,या वैकल्पिक रूप से, जबरन सेल एकत्रीकरण और कॉम्पिटिशन,34के लिए अपकेंद्रित्रण पर भरोसा करने के लिए एक जैव रासायनिक ईसीएम योजक शामिल होता है, जिससे उन्हें सेल निर्देशित माइग्रेशन और स्व-संगठन का अध्ययन करने के लिए कम आदर्श बना दिया जाता है।3436
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत चार ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के तरीकों में ईसीएम-निर्भर और स्वतंत्र रणनीतियां दोनों शामिल हैं, प्रत्येक सरल सेल सीडिंग का उपयोग करके जो सेल-चालित ऑर्गेनॉइड सेल्फ-असेंबली के अवलोकन को सक्षम बनाता है। सभी चार तकनीकों को एक ही सेल निलंबन से किया जा सकता है या कस्टम और सेल-प्रकार समृद्ध आबादी का उपयोग कर सकते हैं। इन तरीकों की एक ताकत वास्तविक समय में ऑर्गेनॉइड स्वयं को इकट्ठा करने की क्षमता है, और सीधे तुलना करने के लिए कि कैसे वृषण संरचनाएं विभिन्न संस्कृति माइक्रोएनवायरमेंट्स के बीच स्वयं को इकट्ठा करती हैं। इन चार संस्कृति विधियों के बीच फेनोटाइपिक मतभेदों को अनुसंधान प्रश्न या अन्वेषक के विषय पर उनके प्रभाव के लिए माना जाना चाहिए । प्रत्येक विधि 24 घंटे या उससे कम के भीतर जैविक निर्माण या ऑर्गेनॉइड का उत्पादन करती है। अंत में, यहां प्रस्तुत किए गए तरीके विट्रो में वृषण ऑर्गेनॉइड असेंबली, ऊतक विकास और वृषण शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए ऑर्गेनॉइड असेंबली तकनीकों का एक टूलकिट प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस ऑर्गेनॉइड जनरेशन प्रोटोकॉल के पूरा होने के साथ, उपयोगकर्ता के पास ईसीएम या ईसीएम-मुक्त वातावरण में वृषण निर्माण और ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करने के लिए उनके पास चार अलग-अलग संस्कृति तकनीकें उपलब्ध होंग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, राष्ट्रीय बाल स्वास्थ्य और मानव विकास संस्थान (NICHD) F31 HD089693, पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान के लिए राष्ट्रीय केंद्र/राष्ट्रीय ट्रांसलेशनल साइंसेज को आगे बढ़ाने के लिए केंद्र (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 और 4UH3ES029073-03, और थॉमस जे वाटकिन के मेमोरियल प्रोफेसरशिप प्रोफेसर द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
लेखक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए एरिक डब्ल्यू रोथ का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । इस काम ने नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी के एनयूANCE सेंटर की बायोक्रेयो सुविधा का उपयोग किया, जिसे सॉफ्ट एंड हाइब्रिड नैनोटेक्नोलॉजी एक्सपेरिमेंटल (SHyNE) संसाधन (एनएसएफ ईसीसीएस-1542205) से समर्थन मिला है; सामग्री अनुसंधान केंद्र में एमआरएसईसी कार्यक्रम (एनएसएफ डीएमआर-1720139); इंटरनेशनल इंस्टीट्यूट फॉर नैनोटेक्नोलॉजी (आईईएन); और इलिनोइस राज्य, आईईन के माध्यम से। इसमें क्रायोक्लस्टर उपकरण का भी इस्तेमाल किया गया, जिसे एमआरआई प्रोग्राम (एनएसएफ डीएमआर-1229693) से सपोर्ट मिला है। चित्रा 1 में ग्राफिक्स BioRender.com का उपयोग करके डिजाइन किए गए थे।
Materials
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5×7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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