細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成
Summary
ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。
Abstract
精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および内分泌学を体外で研究するためのツールを提供します。精巣オルガノイドを作るためにいくつかの方法が開発された。これらの方法の多くは、de novo組織アセンブリを促進するために細胞外マトリックス(ECM)に依存しますが、バイオミメティック形態と組織の機能の点で方法の違いがあります。さらに、公開されたメソッドの直接比較はほとんどありません。ここでは、オルガノイド生成プロトコルの違いを研究することによって直接比較が行われ、結果が得られる。4つの原型生成方法:(1)2D ECMフリー、(2)2D ECM、(3)3D ECMフリー、および(4)3D ECM培養法が記載されている。精巣オルガノイド発生を評価するために3つの主要なベンチマークが使用された。これらは、細胞自己集合体、主要な細胞タイプ(セルトリ、レイディグ、胚芽、および骨膜細胞)を含み、適切に区分された組織アーキテクチャである。試験された4つの環境のうち、2D ECMおよび3D ECMフリー培養は、尿管細胞型と間質細胞型のデノボ区画化、管状構造の開発、確立された長期内分泌機能など、天然精巣に最も類似した内部形態を有するオルガノイドを生成した。研究されたすべての方法は、未ソートの一次マウス精巣細胞懸濁液を利用し、一般的にアクセス可能な培養リソースを使用した。これらの精巣オルガノイド生成技術は、精巣の器官形成および生理学の研究イニシアチブのための非常にアクセス可能で再現性の高いツールキットを提供する。
Introduction
精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および生理学をvitro11、2、3、42,3,4で研究するための先駆的な技術である。オルガノイド生成のためにいくつかの方法が検討されている。これらには、2次元(2D)および3次元(3D)の向きの両方で、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリー培養系が含まれる。異なる生成方法は、明確なセルラーアセンブリ戦略を促進することができます;これにより、公開されたオルガノイドモデル間の形態学的および機能的変動の高いレベルが生じる。この記事の目的は、精巣の器官化実験を設計する際に、体外精巣モデルの現状を議論し、将来の研究者のためのテンプレートとして機能することです。本研究では、4つの異なる培養系のアーキタイプが、実験過程および生物学的結果において定義され、特徴付けられる。これらには、2D ECM フリー、2D ECM、3D ECM フリー、および 3D ECM カルチャメソッドが含まれます。本書に示す戦略は、異なる研究所と研究グループ間で、シンプルでアクセスしやすく、再現性の高い戦略です。
歴史的に精巣のために、「in vitro」という指定は、精巣組織および細胞のいくつかの異なる培養方法のために使用されてきた。これらには、組織/臓器培養方法(すなわち、外植培養)5、単離された半細管培養6、精巣細胞培養7、およびデノボ組織形態形成(すなわち、生物学的構造およびオルガノイド)の方法が含まれる。体外精子形成の最初の調査は約100年前に行われ、ウサギの精巣の培養は19208年に、そして1937年にはマウスの外植体9で外植した。これらの最初の実験の中で、精子は培養の最初の週に大部分が退化することが観察されたが、いくつかのmeiottって分化する細胞が同定された。これらの歴史的な報告を連想させる、精巣培養は2011年に復活し、精巣10を研究するための実現可能な技術になるために最適化された。2011年以来、外植培養は、複数のレポート11、12、13,12で不妊治療の有能な精子を13産生している。しかし、外植培養が既存の在来精巣細管に依存しているため、これらの最近の進歩は、生物の体内からの除去時に維持または再開された組織機能である「ex vivo」精巣機能および精子形成の例としてより正確に記述されている。文献におけるその有病率にもかかわらず、精巣外植物内の長期生殖細胞維持および分化は、特に体外精子形成で完全に観察するのに十分な長さの時間枠にわたって14、15、16、17、18,15,16,17,18を複製することは困難である(ヒトでは19および74のマウスでは35日)。100年前に経験した同じ課題の多くが、今日でもex vivo精子形成の中で経験されていることを理解することは興味深いです。
ex vivoアプローチとは異なり、精巣オルガノイドは、細胞源(すなわち、一次精巣細胞)から完全にインビトロで生成されたデノボ組み立てられたマイクロ組織である。精巣オルガノイドは、既存のネイティブ組織に対するフィールドの歴史的依存を回避し、精巣生物学を完全にインビトロで再現するための創造的な戦略を提供します。ほとんどのオルガノイド組織モデルで共有される複数の要件があります。これらは、(1)生体擬態組織形態またはアーキテクチャにおいて、(2)代表組織の複数の主要な細胞型、(3)その生成における自己集合または自己組織化、および(4)表される組織の機能および生理学21、22、23、2422の一21定レベルをシミュレートする能力を含む。,23,24精巣の場合、これは4つの主要な特徴で捉えることができます:(1)主要な精巣細胞タイプを含む、 胚芽、セルトリ、ライディグ、骨膜、および他の間質細胞、(2)細胞指向組織アセンブリ、(3)適切に区分された細胞型を別々の管状コンパートメント(胚芽およびセルトリ)および間質領域(他のすべての細胞型)、および(4)ある程度の組織機能(例えば、生殖ホルモン分泌または生殖組織応答)および異なる細胞の応答を含む。生殖細胞分化ex vivoおよびin vitroを維持する際の歴史的課題を考慮すると、精巣生理学のシミュレーション(例えば、内分泌)機能を生成することを示唆する追加マーカーを用いた生体内模倣精巣精巣アーキテクチャ(すなわち、半細管に似た構造)の再現は、1日の精子で生殖機能を持続する臓器組織の生成に向けた優先的なマイルストーンである。
公示された精巣オルガノイド法の大部分は、市販のECM(例えば、コラーゲンまたは独自のECM製剤)25、26、27,26,27またはカスタム供給ECM(すなわち、脱細胞化精巣ECM由来ヒドロゲル)28、29、30,29,30を利用する。外因性ECMは、組織生成のための組み立て支持足場を提供することにより、デノボ組織形成を促進する。ECMの方法は、いくつかの生殖細胞の存在と組織模倣形態25、28を含む組織形成の印象的なレベルを28与えている。しかし、彼らが利用するECMは、常に普遍的に入手可能であるとは限らず(すなわち、脱細胞化されたECM由来ヒドロゲル)、そしていくつかの方法は洗練されたゲルおよび細胞の播種の向き(例えば、ECMおよび3D印刷の3層の勾配)25、31、3231,32を必要とする。25足場を含まない方法(例えば、ハンギングドロップおよび非接着培養プレート)33、34、35はまた、ECMゲルまたは足場を必要とせずに堅牢で再現性の高いオルガノイドを生成した。33,34,35しかし、これらの足場を含まないオルガノイドの組織形態は、生体内精巣と異なることが多く、これらの報告のほとんどは、組織形成を促進するために生化学的ECM添加剤を組み込み、33、34、36、34,36または代わりに、強制細胞凝集および圧縮34のための遠心分離に依存し、細胞指向移動および自己組織化を研究するのに理想的ではない。33
本稿で紹介する4つのオルガノイド生成法には、ECM依存性と独立した戦略の両方が含まれ、それぞれが細胞駆動型オルガノイド自己集合の観察を可能にする単純な細胞播種を用いる。4 つの手法はすべて、同じセルの中断から実行することも、カスタムおよびセル型の濃縮された集団を利用することもできます。これらの方法の強みは、オルガノイドをリアルタイムで自己集合的に観察し、精巣構造が異なる培養マイクロ環境間でどのように自己集合するかを直接比較する能力である。これら4つの培養方法の間の語体的な違いは、研究者の研究課題または主題に与える影響について考慮されるべきである。各方法は、24時間以下の生物学的構築物またはオルガノイドを生成する。結論として、ここで提示される方法は、精巣オルガノイドアセンブリ、組織の発達、および精巣生理学を試験的に研究するためのオルガノイド組立技術のツールキットを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このオルガノイド生成プロトコルの完成により、ユーザーはECMまたはECMフリー環境で精巣構造およびオルガノイドを組み立てるために利用可能な4つの異なる培養技術を有する。重要なことに、4つの方法はすべて、研究者がタイムラプスイメージングまたはビデオ記録を通じて時間の経過とともにオルガノイド自己集合を非侵襲的に観察し、培養中に組織を乱すことなく、分泌されたホルモ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所、国立衛生人間開発研究所(NICHD)F31 HD089693、国立環境衛生研究所/国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NIEHS/NCATS)UH3TR001207および4UH3ES029073-03、トーマス・J・ワトキンの記念教授によって資金提供されました。
著者らは、エリック・W・ロスが透過電子顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、ソフトおよびハイブリッドナノテクノロジー実験(SHyNE)リソース(NSF ECCS-1542205)からの支援を受けているノースウェスタン大学のNU ANCE センターのBioCryo施設を利用しました。材料研究センターのMRSECプログラム(NSF DMR-1720139)国際ナノテクノロジー研究所(IIN)そしてイリノイ州、IINを通じて。また、MRIプログラム(NSF DMR-1229693)からサポートを受けているCryoCluster機器を利用しました。図 1 のグラフィックスは、BioRender.comを使用して設計されています。
Materials
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5×7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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