Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide
Summary
Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.
Abstract
Hodenorganoide bieten ein Werkzeug für die Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Endokrinologie in vitro. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Hodenorganoide zu erstellen. Viele dieser Methoden verlassen sich auf extrazelluläre Matrix (ECM), um de novo Gewebe-Montage zu fördern, jedoch gibt es Unterschiede zwischen Denkmethoden in Bezug auf biomimetische Morphologie und Funktion des Gewebes. Darüber hinaus gibt es nur wenige direkte Vergleiche veröffentlichter Methoden. Hier wird ein direkter Vergleich durch die Untersuchung von Unterschieden in Organoid-Generierungsprotokollen, mit bereitgestellten Ergebnissen gemacht. Vier archetypische Erzeugungsmethoden: (1) 2D ECM-frei, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-frei und (4) 3D-ECM-Kultur werden beschrieben. Zur Beurteilung der Hodenorganoid-Erzeugung wurden drei primäre Benchmarks verwendet. Dabei handelt es sich um zelluläre Selbstmontage, Die Einbeziehung wichtiger Zelltypen (Sertoli, Leydig, Keime und peritubäre Zellen) und entsprechend abgeschottete Gewebearchitektur. Von den vier getesteten Umgebungen erzeugten 2D ECM- und 3D-ECM-freie Kulturen Organoide mit internen Morphologien, die nativen Hoden am ähnlichsten sind, einschließlich der De-Novo-Abschottung von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen, der Entwicklung von Tubule-ähnlichen Strukturen und einer etablierten langfristigen endokrinen Funktion. Alle untersuchten Methoden nutzten unsortierte, primäre murine Hodenzellsuspensionen und nutzten allgemein zugängliche Kulturressourcen. Diese Hodenorganoid-Generierungstechniken bieten ein hochzugängliches und reproduzierbares Toolkit für Forschungsinitiativen zur Hodenorganogenese und Physiologie in vitro.
Introduction
Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwischen veröffentlichten Organoidmodellen. Der Zweck dieses Artikels ist es, den aktuellen Zustand von In-vitro-Hodenmodellen zu diskutieren und als Vorlage für zukünftige Forscher bei der Entwicklung von Hodenorganoidexperimenten zu dienen. In der vorliegenden Studie werden vier verschiedene Kultursystemarchetypen definiert und in experimentellen Prozess- und biologischen Ergebnissen charakterisiert. Dazu gehören: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free und 3D ECM Kulturmethoden. Die hier vorgestellten Strategien sollen einfach, zugänglich und zwischen verschiedenen Laboratorien und Forschungsgruppen hochgradig reproduzierbar sein.
Historisch für die Hoden, die Bezeichnung “in vitro”, wurde für mehrere verschiedene Kulturmethoden von Hodengeweben und -zellen verwendet. Dazu gehören organotypische Gewebe-/Organkulturmethoden (d.h. Explantkultur)5, isolierte seminiferöse Tubulenkultur6, Hodenzellkultur7und Methoden der de novo Gewebemorphogenese (d.h. biologische Konstrukte und Organoide)1. Die ersten Untersuchungen zur In-vitro-Spermatogenese wurden vor etwa 100 Jahren mit der Kultur der Kaninchen-Hodenexplantationen 19208und später 1937 mit Mausexplantationen9durchgeführt. Innerhalb dieser ersten Experimente wurden Spermatogonien beobachtet, die in der ersten Kulturwoche weitgehend degenerierten, obwohl einige meiotisch differenzierende Zellen identifiziert wurden. Erinnert an diese historischen Berichte, wurde die Testis-Explantationskultur 2011 wiederbelebt und optimiert, um eine praktikable Technik zum Studium der Hoden10zu werden. Seit 2011 hat explant kultur Fruchtbarkeit kompetente Spermien in mehreren Berichten produziert11,12,13. Doch aufgrund der Abhängigkeit der Explant-Kultur von bereits existierenden nativen Hobules werden diese jüngsten Fortschritte genauer als Beispiele für “ex vivo” Hodenfunktion und Spermatogenese beschrieben, Gewebefunktion, die bei der Entfernung aus dem Körper eines Organismus beibehalten oder wieder aufgenommen wurde. Trotz seiner Prävalenz in der Literatur, langfristige Keimzellerhaltung und Differenzierung innerhalb hoden Explants ist eine Herausforderung zu replizieren14,15,16,17,18, vor allem über Zeitrahmen lang genug, um vollständig zu beobachten In-vitro-Spermatogenese (35 Tage bei Mäusen19 und 74 beim Menschen20). Es ist faszinierend zu erkennen, dass viele der gleichen Herausforderungen, die vor 100 Jahren erlebt wurden, noch heute in der ex vivo Spermatogenese erlebt werden.
Im Unterscheidet sich von Ex-vivo-Ansätzen sind Hodenorganoide de novo zusammengesetzte Mikrotissues, die vollständig in vitro aus zellulären Quellen (d. h. primären Hodenzellen) erzeugt werden. Hodenorganoide bieten eine kreative Strategie, um die historische Abhängigkeit des Feldes von bereits vorhandenem nativem Gewebe zu umgehen und die Hodenbiologie vollständig in vitro zu rekapitulieren. Es gibt mehrere Anforderungen, die von den meisten organoiden Gewebemodellen geteilt werden; Dazu gehören (1) in vivo-mimetische Gewebemorphologie oder Architektur, (2) mehrere Hauptzelltypen des dargestellten Gewebes, (3) Selbstmontage oder Selbstorganisation in ihrer Erzeugung und (4) die Fähigkeit, eine gewisse Ebene der Funktion des dargestellten Gewebes und der Physiologie zu simulieren21,22,23,24. Für die Hoden kann dies in vier Hauptmerkmalen erfasst werden: (1) die Einbeziehung von Haupthodenzelltypen, Keim, Sertoli, Leydig, peritubular und andere interstitielle Zellen, (2) zellgesteuerte Gewebeanordnung, (3) entsprechend kompartalisierte Zelltypen in separate röhrenförmige Kompartimente (Keim und Sertoli) und interstitielle Regionen (alle anderen Zelltypen) und (4) ein gewisses Maß an Gewebefunktion (z. B. Reproduktivhormonsekretion oder Gewebereaktionen und Zellabhängigkeit). Unter Berücksichtigung der historischen Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Keimzelldifferenzierung ex vivo und in vitro sind die Rekapitulation in vivo-mimetischer Hodenarchitekturen (d. h. Strukturen, die seminiferous tubulis ähneln) mit zusätzlichen Markern, die auf die Simulation der Hodenphysiologie (z. B. endokrine Funktion) hindeuten, vorrangige Meilensteine zur Erzeugung von Organoiden, die eines Tages die in vitro erhaltene Spermatogenese aufrechterhalten könnten.
Die meisten veröffentlichten Hodenorganoid-Methoden nutzen kommerziell erhältliche ECM (z.B. Kollagen oder proprietäre ECM-Formulierungen)25,26,27 oder kundenspezifische ECMs (d.h. dezelluläre Hoden ECM-abgeleitete Hydrogele)28,29,30. Exogenes ECM fördert die De-Novo-Gewebebildung durch bereitstellung eines Montage-unterstützenden Gerüstes für die Gewebebildung. ECM-Methoden haben ein beeindruckendes Maß an Gewebebildung ermöglicht, einschließlich einiger Keimzellpräsenz und gewebemimetischer Morphologie25,28. Die von ihnen verwendeten ECMs sind jedoch nicht immer universell verfügbar (d. h. dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele), und einige Methoden erfordern ausgeklügelte Gel- und Zellsaatausrichtungen (z. B. 3-Schicht-Gradienten des ECM- und 3D-Drucks)25,31,32. Gerüstfreie Methoden (z.B. hängende Tropfen und nicht haftende Kulturplatten)33,34,35 haben auch robuste und hoch reproduzierbare Organoide ohne ECM-Gele oder Gerüste erzeugt. Jedoch, die Gewebemorphologie dieser Gerüst-freien Organoide ist oft unähnlich zu in vivo Hoden, und die meisten dieser Berichte enthalten eine biochemische ECM-Additiv zur Förderung der Gewebebildung33,34,36, oder alternativ, verlassen sich auf Zentrifugierung für erzwungene Zellaggregation und Verdichtung34, so dass sie weniger ideal für die Untersuchung zellgesteuerte Migration und Selbstorganisation.
Die vier in diesem Manuskript vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden umfassen sowohl ECM-abhängige als auch unabhängige Strategien, die jeweils eine einfache Zellaussaat verwenden, die die Beobachtung der zellgesteuerten organoiden Selbstmontage ermöglicht. Alle vier Techniken können aus denselben Zellsuspensionen ausgeführt werden oder benutzerdefinierte und zelltypangereicherte Populationen verwenden. Eine Stärke dieser Methoden ist die Fähigkeit, Organoide in Echtzeit selbst zu beobachten und direkt zu vergleichen, wie hodenförmige Strukturen sich zwischen verschiedenen Kulturmikroumgebungen selbst zusammensetzen. Die phänotischen Unterschiede zwischen diesen vier Kulturmethoden sollten wegen ihrer Auswirkungen auf die Forschungsfrage oder das Thema des Prüfers berücksichtigt werden. Jede Methode produziert biologische Konstrukte oder Organoide innerhalb von 24 h oder weniger. Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden ein Toolkit von organoiden Montagetechniken zum Studium der Hodenorganoid-Montage, Gewebeentwicklung und Hodenphysiologie in vitro bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit der Fertigstellung dieses Organoid-Generierungsprotokolls stehen dem Benutzer vier verschiedene Kulturtechniken für die Montage von Hodenkonstrukten und Organoiden in ECM- oder ECM-freien Umgebungen zur Verfügung. Wichtig ist, dass alle vier Methoden es dem Forscher ermöglichen, die organoide Selbstmontage im Laufe der Zeit durch Zeitraffer-Bildgebung oder Videoaufzeichnung nicht-invasiv zu beobachten und konditionierte Medien für die Analyse von abgesonderten Hormonen und Zytokinen zu sammeln, ohne das Gewebe w?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dem National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 und 4UH3ES029073-03 und der Thomas J. Watkin es Memorial Professorship finanziert.
Die Autoren danken Eric W. Roth für die Unterstützung bei der Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von der BioCryo-Anlage des NUANCE Center der Northwestern University genutzt, die von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205) unterstützt wurde. das MRSEC-Programm (NSF DMR-1720139) am Materials Research Center; das Internationale Institut für Nanotechnologie (IIN); und dem Staat Illinois durch die IIN. Es nutzt auch die CryoCluster-Ausrüstung, die vom MRT-Programm (NSF DMR-1229693) unterstützt wurde. Grafiken in Abbildung 1 wurden mit BioRender.com entworfen.
Materials
| 0.22 um Media Sterile Filters | Millipore Sigma | scgpu05re | For sterile filtering media |
| 3βHSD primary antibody | Cosmo Bio Co | K0607 | Leydig cell marker, 1:500 dilution |
| AlexaFluor 568 α-Mouse | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| AlexaFluor 568 α-Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | Fluorescence-tagged secondary antibody |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific | 11-095-080 | Base of culture media |
| Collagenase I | Worthington Bio | LS004197 | For dissociation solution 1 |
| Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels |
| Countess Cell counter | Thermo Fisher Scientific | C10227 | Autmated cell counter (hemacytometer machine) |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | Hemacytometer slide for use with Countess automated counter |
| DDX4 primary antibody | Abcam | 138540 | Spermatogonia marker, 1:500 dilution |
| Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | For dissociation solution 1 |
| DPBS 1X, + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | For reconstituting Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | For reconstituting Collagenase I and Dnase I |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | For quencing enzyme dissocation solutions |
| Follicle stimulating hormone | Abcam | ab51888 | For long-term organoid culture |
| Human chorionic gonadotropin | Millipore Sigma | C1063 | For long-term organoid culture |
| Hyaluronidase, from bovine testes | Millipore Sigma | H4272 | For dissociation solution 2 |
| Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Serum source for Basal media |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5×7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | For 3D ECM-Free organoid fabrication |
| Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | Antibiotic for media |
| Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | For aiding paraffin embedding |
| SOX9 primary antibody | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker, 1:500 dilution |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | Mouse food without phytoestrogens |
| Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance) | Teklad Global | 2916 | Mouse food without phytoestrogens |
| Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | For cell counting |
| αSMA primary antibody | Millipore Sigma | A2547 | Peritubular marker, 1:500 dilution |
| βCatenin primary antibody | BD Biosciences | 610154 | Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution |
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