गैर-हेपेटिक 293T-NE-3NRs कोशिकाओं में हेपेटाइटिस बी वायरस संक्रमण मॉडलिंग
Summary
यह पांडुलिपि मानव NTCP, HNF4α, RXRα और PPARα) और पारंपरिक हेपेटिक कोशिकाओं (HepG2-NE, मानव NTCP व्यक्त) को व्यक्त करते हुए, उपन्यास इंजीनियर 293T कोशिकाओं (293T-NE-3NRs) में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) संक्रमण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।
Abstract
एचबीवी मुख्य रूप से मानव हेपेटोसाइट्स को संक्रमित करता है, लेकिन यह किडनी और टेस्टिस जैसे बाहरी ऊतकों को संक्रमित करने के लिए भी पाया गया है। फिर भी, सेल-आधारित एचबीवी मॉडल हेपेटोमा सेल लाइनों (जैसे हेपजी2 और हुह 7) तक सीमित हैं, जो एक कार्यात्मक एचबीवी रिसेप्टर, सोडियम तौरोकोटल सह-परिवहन पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) से अधिक है। यहां, हमने मॉडल सेल लाइनों के रूप में 293T-NE-3NRs (293T ओवरएक्सप्रेसिंग ह्यूमन एनटीसीपी, एचएनएफ4α, RXRα और PPARα) और हेपजी2-एनई (हेपजी2 ओवरएक्सप्रेसिंग एनटीसीपी) का उपयोग किया। इन सेल लाइनों में एचबीवी संक्रमण या तो HepG2.2.15 से केंद्रित एचबीवी वायरस कणों का उपयोग करके या लक्ष्य सेल लाइनों के साथ सह-संस्कृति हेपजी2.2.15 द्वारा किया गया था। एचबीसीएज के लिए एचबीसीएज इम्यूनोफ्लोरेसेंस एचबीवी संक्रमण की पुष्टि के लिए किया गया था। यहां प्रस्तुत दो तरीकों से हमें गैर-हेपेटिक सेल लाइनों में एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने में मदद मिलेगी।
Introduction
हेपेटाइटिस बी 2 अरब से अधिक लोगों के जीवन को प्रभावित करता है और सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए प्रमुख खतरों में से एक है। लगभग 257 मिलियन लोग दुनिया भर में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) से लंबे समय से संक्रमित हैं, जिससे समाज के लिए एक बड़ा बोझ पैदा हो रहा है1। हेपेटोसाइट्स एचबीवी और गैर-हेपेटिक ऊतकों में अन्य कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाएं नहीं हैं, जैसे गुर्दे और टेस्टिस, इस वायरस2,,3से भी संक्रमित हैं। वर्तमान में, एचबीवी संक्रमण सेल मॉडल केवल कुछ गैर-हेपेटिक सेल लाइन मॉडल के साथ मानव हेपेटोसाइट्स तक सीमित हैं। इससे एचबीवी इंफेक्शन और एचबीवी से संबंधित पैथोलॉजी नॉन हेपेटिक टिश्यू के अध्ययन में बाधा आती है। यहां हम गैर-हेपेटिक 293T कोशिकाओं के साथ-साथ हेपेटोमा-आधारित कोशिकाओं में एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
सोडियम तौरोरोलेट सह परिवहन पॉलीपेप्टाइड (एनटीसीपी) मानव हेपेटाइटिस बी और हेपेटाइटिस डी वायरस4के लिए एक कार्यात्मक रिसेप्टर है । हेपेटोसाइट परमाणु कारक 4α (HNF4α), रेटिनोइड एक्स रिसेप्टर α (RXRα) और पेरोक्सिसोम प्रोलिफरेटर-सक्रिय रिसेप्टर α (PPARα) जिगर से समृद्ध प्रतिलेखन कारक हैं जो एचबीवी के वायरल ट्रॉपिज्म को प्रतिबंधित करते हैं। उन्हें एचबीवी प्रीजेनोमिक आरएनए संश्लेषण को बढ़ावा देने और नॉनहेपेटोमा सेल लाइन5में एचबीवी प्रतिकृति का समर्थन करने के लिए सत्यापित किया गया है । हमने एनटीसीपी (हेपजी2-एनई), 293T सेल लाइन को व्यक्त करते हुए एनटीसीपी (293T-NE) और 293T सेल लाइन को व्यक्त करते हुए तीन अलग-अलग सेल लाइनों का निर्माण किया; एनटीसीपी, एचएनएफ4α, आरएक्सआरα और पीपीएआर α (293T-NE-3NRs)। एचबीवी संक्रमण के लिए दो तरीके 293T-NE-3NRs(चित्रा 1) केआधार पर विकसित किए गए थे । पहली विधि 24 घंटे के लिए उच्च वायरल जीनोम तुल्यता (उच्च GEq (150), DMSO और PEG8000) के साथ 293T-NE-3NRs में टीका का उपयोग करता है। दूसरी विधि हेपजी2.2.15 के साथ 293T-NE-3NRs को सह-संस्कृति को नियोजित करती है, जो डीएमएसओ और PEG8000 के बिना एचबीवी कणों (कम जीईक्यू (लगभग 1.83) का उत्पादन कर सकती है, इस प्रकार प्राकृतिक स्थितियों का अनुकरण करती है।
हेपजी 2.2.15 कोशिकाएं हेपजी 2 लाइन से प्राप्त होती हैं और लंबे समय से संक्रामक एचबीवी को स्रावित करती हैं, साथ ही संस्कृति माध्यम6,,7में उपवायरल कणों को भी स्रावित करती हैं। साइक्लोस्पोरिन ए (सीएसए) एक इम्यूनोसप्रेसेंट है जो चिकित्सकीय रूप से ज़ेनोबेड़ा अस्वीकृति के दमन के लिए उपयोग किया जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि सीएसए एनटीसीपी की ट्रांसपोर्टर गतिविधि को बाधित करके और एनटीसीपी के बाइंडिंग को बड़े लिफाफे प्रोटीन8में अवरुद्ध करके सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स में एचबीवी प्रवेश को रोकता है ।
HepG2-NE कोशिकाओं को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था जबकि सीएसए का इलाज कोशिकाओं को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण समूहों के साथ तुलना करके, हम पता लगा सकते हैं कि एचबीवी संक्रमण में कौन सा मेजबान जीन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अतिरिक्त, एचबीवी संक्रमण के इस तरीके के माध्यम से, हम एचबीवी संक्रमण में शामिल अन्य उपन्यास तंत्र या मेजबान जीन भी पा सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम गैर-हेपेटिक 293T-NE-3NRs और हेपेटोमा आधारित हेपजी2-एनई कोशिकाओं में एचबीवी संक्रमण के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। 293T-NE-3NRs उच्च और निम्न दोनों GEq पर एचबीवी संक्रमण के लिए उपयुक्त थे। हमारे प्रोटोकॉल का उप?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 81870432 और 81570567 से X.L.Z.), (नंबर 81571994 से पी.एन.एस.), इंटरनेशनल यंग साइंटिस्ट्स के लिए रिसर्च फंड (नंबर 81950410640 से डब्ल्यूआई) द्वारा समर्थित किया गया था; ली का शिंग शांतोउ यूनिवर्सिटी फाउंडेशन (नहीं । L1111 2008 से P.N.S.) । हम शंतू यूनिवर्सिटी मेडिकल कॉलेज के प्रो स्टेनली लिन को उपयोगी सलाह के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ।
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
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