Summary

Modellierung der Hepatitis-B-Virusinfektion in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs-Zellen

Published: June 05, 2020
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Summary

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Hepatitis-B-Virus-Infektion (HBV) in neuartigen 293T-Zellen (293T-NE-3NRs, die menschliche NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und traditionelle Leberzellen (HepG2-NE, exzessizierenden menschlichen NTCP) exdrücken.

Abstract

HBV infiziert hauptsächlich menschliche Hepatozyten, aber es wurde auch gefunden, um extrahepatische Gewebe wie Niere und Hoden zu infizieren. Dennoch sind zellbasierte HBV-Modelle auf Hepatom-Zelllinien (wie HepG2 und Huh7) beschränkt, die einen funktionellen HBV-Rezeptor, Natrium-Taurochoat-Co-Transport-Polypeptid (NTCP), überausdrücken. Hier verwendeten wir 293T-NE-3NRs (293T überexpressing human NTCP, HNF4, RXR und PPAR) und HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) als Modellzellenlinien.   Die HBV-Infektion in diesen Zelllinien wurde entweder unter Verwendung konzentrierter HBV-Viruspartikel aus HepG2.2.15 oder durch kokultivierende HepG2.2.15 mit den Zielzelllinien durchgeführt. HBcAg Immunfluoreszenz für HBcAg wurde durchgeführt, um HBV-Infektion zu bestätigen. Die beiden hier vorgestellten Methoden werden uns helfen, HBV-Infektionen in nicht-hepatischen Zelllinien zu untersuchen.

Introduction

Hepatitis B betrifft das Leben von mehr als 2 Milliarden Menschen und ist eine der größten Bedrohungen für die öffentliche Gesundheit. Weltweit sind rund 257 Millionen Menschen chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert, was dieGesellschaftschwer belastet 1 . Hepatozyten sind nicht die einzigen Zellen, die von HBV und anderen Zellen in nicht-hepatischem Gewebe infiziert sind, wie Niere und Hoden, sind auch mit diesem Virus infiziert2,3. Derzeit sind HBV-Infektionszellmodelle auf menschliche Hepatozyten mit nur wenigen nicht-hepatischen Zelllinienmodellen beschränkt. Dies behindert die Untersuchung der HBV-Infektion und der HBV-bedingten Pathologie von nicht-hepatischen Geweben. Hier stellen wir Protokolle zur Untersuchung der HBV-Infektion in nicht-hepatischen 293T-Zellen sowie in Häpatom-basierten Zellen vor.

Natriumtaurocholat Co-Transporting Polypeptid (NTCP) ist ein funktioneller Rezeptor für menschliche Hepatitis B und Hepatitis D Virus4. Hepatozyten-Kernfaktor 4 (HNF4), Retinoid-X-Rezeptor (RXR) und Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR) sind leberangereicherte Transkriptionsfaktoren, die den viralen Tropismus von HBV einschränken. Sie wurden verifiziert, um die vorgenomische RNA-Synthese der HBV zu fördern und die HBV-Replikation in einer Nichthäpatom-Zelllinie5zu unterstützen. Wir konstruierten drei verschiedene Zelllinien, HepG2-Zelllinien, die NTCP (HepG2-NE), 293T-Zelllinie exzätsierend NTCP (293T-NE) und 293T Zelllinie, die vier Wirtsgene exizieren; NTCP, HNF4, RXR und PPAR (293T-NE-3NRs). Auf der Grundlage von 293T-NE-3NRs wurden zwei Methoden zur HBV-Infektion entwickelt (Abbildung 1). Die erste Methode verwendet die Impfung in 293T-NE-3NRs mit hoher viraler Genomäquivalenz (hohe GEq (150), DMSO und PEG8000) für 24 h. Die zweite Methode verwendet co-culturing 293T-NE-3NRs mit HepG2.2.15, die HBV-Partikel (niedrige GEq (ca. 1,83) ohne DMSO und PEG8000 produzieren können, wodurch die natürlichen Bedingungen eng nachgeahmt werden.

HepG2.2.15-Zellen werden aus der HepG2-Linie abgeleitet und seiteln chronisch infektiöse HBV sowie subvirale Partikel in das Kulturmedium6,7. Cyclosporin A (CsA) ist ein Immunsuppressivum, das klinisch zur Unterdrückung der Xenograft-Abstoßung verwendet wird. Studien haben gezeigt, dass CsA den HBV-Eintrag in kultivierte Hepatozyten hemmt, indem es die Transporteraktivität von NTCP hemmt und die Bindung von NTCP an große Hüllproteine blockiert8.

HepG2-NE-Zellen wurden als Positivkontrolle verwendet, während CsA-behandelte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Im Vergleich zu den positiven und negativen Kontrollgruppen können wir herausfinden, welche Wirtsgene bei der HBV-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Darüber hinaus können wir durch diese Art der HBV-Infektion auch andere neuartige Mechanismen oder Wirtsgene finden, die an einer HBV-Infektion beteiligt sind.

Protocol

Kultur, Sammlung von Überstandstoffen aus HepG2.2.15-Zellen und HBV-Infektion sollte in Biosicherheits-Level II (P2) oder Biosicherheits-Level III (P3) Labor nach der Biosicherheits-Anleitung im Land durchgeführt werden. Die Sicherheitspraktiken im Labor sollten befolgt werden, um die Sicherheit des Laborpersonals zu gewährleisten, und alle sollten geimpft und HBsAb-positiv nachgewiesen werden, bevor HBV-Experimente durchgeführt werden. Beobachten Sie den Zustand der Zellen bei jedem Schritt, bevor Sie mit dem nächs…

Representative Results

Wir konstruierten pSIN-NTCP-EGFP Plasmid, das NTCP und EGFP Fusion und mit Puromycin-Resistenz ausdrückt. Das Plasmid wurde in HepG2- und 293T-Zellen transfiziert, um stabile Zelllinien HepG2-NE und 293T-NE zu konstruieren, die NTCP und EGFP exzättieren. Plasmide (pSIN-HNF4, pSIN-RXR, pLV-PPAR-puro-flag) mit Puromycinresistenz und Expression wurden in 293T-NE-Zellen transfiziert, um eine stabile Zelllinie zu konstruieren, die 4 Wirtsgene9exektiert. Die Expression von NTCP-EGFP kann durch grüne …

Discussion

Hier führen wir Protokolle für HBV-Infektionen in nicht-hepatischen 293T-NE-3NRs und Hepatom-basierten HepG2-NE-Zellen ein. 293T-NE-3NRs waren sowohl bei hohen als auch niedrigen GEq-Infektionen für HBV-Infektionen geeignet. Bei der Verwendung unseres Protokolls müssen die folgenden kritischen Schritte berücksichtigt werden. Der Zellstatus ist ein wichtiger Faktor für eine erfolgreiche Infektion. Das Infektionsmedium muss rechtzeitig nach der Anfangsperiode der HBV-Infektion gewechselt werden. 293T-NE-3NRs-Zellen s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81870432 und 81570567 bis X.L.Z.), (Nr. 81571994 bis P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (Nr. 81950410640 bis W.I.) unterstützt. Die Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 bis P.N.S.). Wir danken Prof. Stanley Lin vom Shantou University Medical College für ihre sachdienliche Beratung.

Materials

0.45μm membrane filter Millex-HV SLHU033RB Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate BIOFIL TCP010006 For co-culture
Amicon Ultra 15 ml Millipore UFC910008 For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA Beyotime ST023 For immunofluorescence assay
Cyclosporin A Sangon biotech 59865-13-3 inhibitor of HBV infection
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) DAAN GENE 7265-2013 For HBV DNA detection
DMEM HyClong SH30243.01 For culture medium
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum(FBS) CLARK Bioscience FB25015 For culture medium
Fluorescence microscope ZEISS Axio observer Z1 For immunofluorescence assay
HepG2-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
HBcAg antibody ZSGB-BIO ZA-0121 For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS ZSGB-BIO ZLI-9062 For cell wash
PEG8000 Merck P8260 For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Thermo Fisher 10378016 For culture medium
Transwell CORNING 3412 For co-culture
Tween 20 sigma-Aldrich WXBB7485V For PBST
Virkon Douban 6971728840012 Viruside

References

  1. World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
  2. Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
  3. Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
  4. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
  5. Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
  6. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
  7. Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
  8. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
  9. Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
  10. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  11. Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
  12. Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
  13. Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
  14. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).

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Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia Koutb Megahed, F., Zhou, Q., Liu, T., Iqbal, W., Sun, P., Zhou, X. Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells. J. Vis. Exp. (160), e61414, doi:10.3791/61414 (2020).

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