Summary

Modélisation de l’infection par le virus de l’hépatite B dans les cellules non hépatiques 293T-NE-3NRs

Published: June 05, 2020
doi:

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) dans de nouvelles cellules 293T (293T-NE-3NR, exprimant des NTCP humains, HNF4α, RXRα et PPARα) et des cellules hépatiques traditionnelles (PleG2-NE, exprimant le NTCP humain).

Abstract

Le VHB infecte principalement les hépatocytes humains, mais il a également été trouvé pour infecter les tissus extrahépatiques tels que les reins et les testicules. Néanmoins, les modèles de VHB à base de cellules sont limités aux lignées cellulaires d’hépatome (comme HepG2 et Huh7) surexprimant un récepteur fonctionnel du VHB, le polypeptide co-transport du taurocholate de sodium (NTCP). Ici, nous avons utilisé 293T-NE-3NRs (293T surexprimant NTCP humain, HNF4α, RXRα et PPARα) et HepG2-NE (HepG2 surexprimant NTCP) comme lignées cellulaires de modèle.   L’infection par le VHB dans ces lignées cellulaires a été effectuée soit en utilisant des particules concentrées du virus du VHB provenant d’HepG2.2.15, soit en co-organisant des hepG2.2.15 avec les lignées cellulaires cibles. L’immunofluorescence de HBcAg pour HBcAg a été exécutée pour confirmer l’infection de VHB. Les deux méthodes présentées ici nous aideront à étudier l’infection par le VHB dans les lignées cellulaires non hépatiques.

Introduction

L’hépatite B affecte la vie de plus de 2 milliards de personnes et constitue l’une des principales menaces pour la santé publique. Environ 257 millions de personnes sont infectées de façon chronique par le virus de l’hépatite B (VHB) dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau pour la société1. Les hépatocytes ne sont pas les seules cellules infectées par le VHB et d’autres cellules dans les tissus non hépatiques, comme les reins et les testicules, sont également infectées par ce virus2,3. À l’heure actuelle, les modèles de cellules d’infection par le VHB sont limités aux hépatocytes humains avec seulement peu de modèles de lignée cellulaire non hépatique. Cela entrave l’étude de l’infection par le VHB et de la pathologie liée au VHB des tissus non hépatiques. Ici, nous présentons des protocoles pour étudier l’infection par le VHB dans les cellules non hépatiques 293T ainsi que dans les cellules à base d’hépatome.

Le polypeptide de co-transport du taurocholate de sodium (NTCP) est un récepteur fonctionnel de l’hépatite B humaine et du virus de l’hépatite D4. Le facteur nucléaire hépatocyte 4α (HNF4α), le récepteur X rétinoïde α (RXRα) et le récepteur α (PPARα) activé par proliférateur peroxisome sont des facteurs de transcription enrichis en foie qui limitent le tropisme viral du VHB. Ils ont été vérifiés pour promouvoir la synthèse prégénomique de l’ARN du VHB et soutenir la réplication du VHB dans une ligne de cellules non hépatomes5. Nous avons construit trois lignées cellulaires différentes, des lignées cellulaires HepG2 exprimant NTCP (HepG2-NE), une lignée cellulaire 293T exprimant NTCP (293T-NE) et une lignée cellulaire 293T exprimant quatre gènes hôtes; NTCP, HNF4α, RXRα et PPARα (293T-NE-3NR). Deux méthodes d’infection par le VHB ont été développées sur la base de 293T-NE-3NR (figure 1). La première méthode utilise l’inoculation dans 293T-NE-3NR avec une équivalence élevée du génome viral (GEq élevé (150), DMSO et PEG8000) pendant 24 h. La deuxième méthode utilise la co-culture 293T-NE-3NRs avec HepG2.2.15, qui peut produire des particules de VHB (faible GEq (environ 1,83) sans DMSO et PEG8000), imitant ainsi étroitement les conditions naturelles.

Les cellules hepG2.2.15 sont dérivées de la lignée HepG2 et sécrètent chroniquement le VHB infectieux, ainsi que les particules subvirales dans le milieu de culture6,7. La cyclosporine A (CsA) est un immunosuppresseur cliniquement utilisé pour la suppression du rejet de xénogreffe. Des études ont montré que le CsA inhibe l’entrée du VHB dans les hépatocytes cultivés en inhibant l’activité du transporteur du NTCP et en bloquant la liaison du NTCP aux protéines de grande enveloppe8.

Les cellules d’hepG2-NE ont été employées comme commande positive tandis que les cellules traitées de CsA ont été employées comme contrôle négatif. En comparant avec les groupes témoins positifs et négatifs, nous pouvons savoir quels gènes hôtes jouent un rôle critique dans l’infection par le VHB. En outre, grâce à ce mode d’infection par le VHB, nous pouvons également trouver d’autres mécanismes nouveaux ou des gènes hôtes impliqués dans l’infection par le VHB.

Protocol

La culture, la collecte de supernatants provenant des cellules HepG2.2.15 et l’infection par le VHB doivent être effectuées en laboratoire de niveau BIOSécurité II (P2) ou de biosécurité III (P3), selon les directives de biosécurité dans le pays. Les pratiques de sécurité en laboratoire devraient être suivies pour assurer la sécurité du personnel de laboratoire, et tous devraient être vaccinés et détectés HBsAb positif avant d’effectuer des expériences VHB. Observez l’état des cellules à chaque …

Representative Results

Nous avons construit le plasmide pSIN-NTCP-EGFP exprimant la fusion NTCP et EGFP et avec la résistance à la puromycine. Le plasmide a été transfecté en cellules HepG2 et 293T pour construire des lignées cellulaires stables HepG2-NE et 293T-NE exprimant NTCP et EGFP. Les plasmides (pSIN-HNF4α, pSIN-RXRα, pLV-PPARα-puro-flag) avec résistance et expression de puromycine ont été transfectés en cellules 293T-NE pour construire une lignée cellulaire stable exprimant 4 gènes hôtes9. L’e…

Discussion

Ici, nous introduisons des protocoles pour l’infection par le VHB dans les cellules 293T-NE-3NR non hépatiques et les cellules hepG2-NE à base d’hépatome. 293T-NE-3NRs étaient appropriés pour l’infection de VHB à la fois haut et bas GEq. Les étapes critiques suivantes doivent être prises en considération lors de l’utilisation de notre protocole. Le statut cellulaire est un facteur important pour une infection réussie. Le milieu d’infection doit être modifié en temps opportun après la période initi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (no 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (no 81571994 à P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (no 81950410640 à W.I.); La Fondation de l’Université Li Ka Shing Shantou (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le Professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.

Materials

0.45μm membrane filter Millex-HV SLHU033RB Filter for HepG 2.2.15 supernatant
293T-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
293T-NE-3NRs Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
594 labeled goat against rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For immunofluorescence assay,second antibody
6-well plate BIOFIL TCP010006 For co-culture
Amicon Ultra 15 ml Millipore UFC910008 For concentration of HepG 2.2.15 supernatant
BSA Beyotime ST023 For immunofluorescence assay
Cyclosporin A Sangon biotech 59865-13-3 inhibitor of HBV infection
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) DAAN GENE 7265-2013 For HBV DNA detection
DMEM HyClong SH30243.01 For culture medium
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For improvement of infection efficiency
Fetal bovine serum(FBS) CLARK Bioscience FB25015 For culture medium
Fluorescence microscope ZEISS Axio observer Z1 For immunofluorescence assay
HepG2-NE Laboratory construction —— Cell model for HBV infection
HBcAg antibody ZSGB-BIO ZA-0121 For immunofluorescence assay, primary antibody
PBS ZSGB-BIO ZLI-9062 For cell wash
PEG8000 Merck P8260 For infection medium
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Thermo Fisher 10378016 For culture medium
Transwell CORNING 3412 For co-culture
Tween 20 sigma-Aldrich WXBB7485V For PBST
Virkon Douban 6971728840012 Viruside

References

  1. World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
  2. Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
  3. Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
  4. Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
  5. Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
  6. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
  7. Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
  8. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
  9. Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
  10. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  11. Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
  12. Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
  13. Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
  14. Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).

Play Video

Cite This Article
Sun, X., Yang, X., Zeng, C., Attia Koutb Megahed, F., Zhou, Q., Liu, T., Iqbal, W., Sun, P., Zhou, X. Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells. J. Vis. Exp. (160), e61414, doi:10.3791/61414 (2020).

View Video