النمذجة التهاب الكبد الوبائي باء العدوى بفيروس في الخلايا غير الكبدية 293T-NE-3NRs
Summary
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلاً لعدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) في الخلايا 293T الجديدة المهندسة (293T-NE-3NRs، التي تعبر عن بروتP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) والخلايا الكبدية التقليدية (HepG2-NE، التعبير عن الـ NTCP البشري).
Abstract
HBV يصيب أساسا الكبدات البشرية، ولكن تم أيضا العثور على أن تصيب الأنسجة خارج الكبد مثل الكلى والخصية. ومع ذلك، تقتصر نماذج HBV القائمة على الخلايا على خطوط خلايا الكبد (مثل HepG2 و Huh7) بشكل مفرط في مستقبلات HBV الوظيفية، توروشولاتي الصوديوم شارك في نقل بوليبيبتيد (NTCP). هنا، استخدمنا 293T-NE-3NRs (293T OVEREXP الإنسان، HNF4α، RXRα وPPARα) وHpG2-NE (HEpG2 OVEREXPRESSING) كطريف الخلايا النموذجية. وقد أجريت العدوى بفيروس التهاب الكبد B في هذه الخطوط الخلوية إما باستخدام جزيئات فيروس HBV المركزة من HepG2.2.15 أو شارك في زراعة HepG2.2.15 مع خطوط الخلايا المستهدفة. تم إجراء الفلور المناعية HBcAg لHBcAg لتأكيد عدوى HBV. الطريقتان المقدمتان هنا ستساعدنا على دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد في خطوط الخلايا غير الكبدية.
Introduction
ويؤثر التهاب الكبد B على حياة أكثر من ملياري شخص، وهو أحد التهديدات الرئيسية للصحة العامة. ما يقرب من 257 مليون شخص مصابين بشكل مزمن بفيروس التهاب الكبد B (HBV) في جميع أنحاء العالم، مما تسبب في عبء كبير على المجتمع1. خلايا الكبد ليست هي الخلايا الوحيدة المصابة بفيروس التهاب الكبد والخلايا الأخرى في الأنسجة غير الكبدية، مثل الكلى والخصيتين، هي أيضا مصابة بهذا الفيروس2،3. حاليا, نماذج خلايا عدوى HBV تقتصر على خلايا الكبد البشرية مع نماذج خط الخلية غير الكبدية فقط. وهذا يعوق دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد الوبائي والأمراض المرتبطة بهبسج الكبدي من الأنسجة غير الكبدية. هنا نقدم بروتوكولات لدراسة عدوى HBV في الخلايا 293T غير الكبدية وكذلك في الخلايا التي تعتمد على الكبد.
الصوديوم taurocholate شارك في نقل بوليبيببتيد (NTCP) هو مستقبل وظيفي لالتهاب الكبد البشري B والتهاب الكبد D فيروس4. العامل النووي الكبدي 4α (HNF4α)، مستقبلات ريتينويد X α (RXRα) ومستقبلات التكاثر المنشط البيروكسي (PPARα) هي عوامل النسخ المخصبة بالكبد التي تقيد التروبيزم الفيروسي لـ HBV. وقد تم التحقق منها لتعزيز HBV تخليق الحمض النووي الريبي ودعم النسخ المتماثل HBV في خط الخلية nonhepatoma5. نحن شيدت ثلاثة خطوط الخلايا المختلفة, HepG2 خطوط الخلية التي تعبر عن نتب (HepG2-NE), 293T خط الخلية التعبير عن NTCP (293T-NE) و 293T خط الخلية 293T التعبير عن أربعة الجينات المضيفة; (ب) نظام الـ NTCP، HNF4α، RXRα وPPARα (293T-NE-3NRs). وقد وضعت طريقتين للعدوى HBV على أساس 293T-NE-3NRs (الشكل 1). الأسلوب الأول يستخدم التلقيح في 293T-NE-3NRs مع معادلة عالية من الجينوم الفيروسي (GEq عالية (150)، DMSO وPEG8000) لمدة 24 ساعة. وتستخدم الطريقة الثانية 293T-NE-3NRs مع HepG2.2.15، والتي يمكن أن تنتج جزيئات HBV (GEq منخفضة (حوالي 1.83) دون DMSO و PEG8000)، وبالتالي محاكاة الظروف الطبيعية بشكل وثيق.
وتستمد خلايا HepG2.2.15 من خط HepG2 وإفراز مزمن HBV المعدية، فضلا عن جزيئات تحت فيروسات في وسط الثقافة6،7. السيكلوسبورين A (CsA) هو مناعة تستخدم سريريا لقمع رفض xenograft. وقد أظهرت الدراسات أن CsA يمنع دخول HBV في الكبد المستزرعة عن طريق تثبيط نشاط الناقل من NTCP ومنع ربط نتاب لبروتينات المغلف كبيرة8.
استخدمت خلايا HEPG2-NE كتحكم إيجابي في حين تم استخدام الخلايا المعالجة CsA كتحكم سلبي. من خلال المقارنة مع مجموعات التحكم الإيجابية والسلبية ، يمكننا معرفة الجينات المضيفة التي تلعب دورًا حاسمًا في عدوى فيروس التهاب الكبد B. بالإضافة إلى ذلك، من خلال هذا الوضع من عدوى فيروس التهاب الكبد B، يمكننا أيضا العثور على آليات جديدة أخرى أو الجينات المضيفة المشاركة في عدوى فيروس التهاب الكبد B.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم بروتوكولات لعدوى فيروس التهاب الكبد في خلايا HEPG2-NE غير الكبدية 293T-NE-3NRs والخلايا الكبدية القائمة على الكبد. 293T-NE-3NRs كانت مناسبة لعدوى HBV في كل من GEq عالية ومنخفضة. وينبغي أن تؤخذ في الاعتبار الخطوات الحاسمة التالية عند استخدام البروتوكول. حالة الخلية هو عامل مهم لنجاح العدوى. يجب تغي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (رقم 81870432 و81570567 إلى X.L.Z.) (رقم 81571994 إلى P.N.S.) وصندوق الأبحاث للعلماء الشباب الدوليين (رقم 81950410640 إلى W.I.)؛ مؤسسة جامعة لي كا شينغ شانتو (رقم 1999-1999). L1111 2008 إلى P.N.S.). نود أن نشكر البروفيسور ستانلي لين من كلية الطب بجامعة شانتو على المشورة المفيدة.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
