Modellering Hepatitis B Virus Infektion i ikke-hepatisk 293T-NE-3NRs celler
Summary
Dette manuskript beskriver en detaljeret protokol for Hepatitis B-virus (HBV) infektion i nye manipuleret 293T celler (293T-NE-3NRs, der udtrykker menneskelige NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og traditionelle leverceller (HepG2-NE, der udtrykker menneskelige NTCP).
Abstract
HBV hovedsageligt inficerer humane hepatocytter, men det har også vist sig at inficere extrahepatic væv såsom nyre og testikler. Ikke desto mindre er cellebaserede HBV-modeller begrænset til hepatomacellelinjer (såsom HepG2 og Huh7), der overexpresserer en funktionel HBV-receptor, natrium taurocholate-co-transport af polypeptid (NTCP). Her brugte vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing humanE NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα) og HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modelcellelinjer. HBV-infektion i disse cellelinjer blev udført enten ved hjælp af koncentrerede HBV-viruspartikler fra HepG2.2.15 eller ved co-culturing HepG2.2.15 med målcellelinjerne. HBcAg immunofluorescens for HBcAg blev udført for at bekræfte HBV-infektion. De to metoder, der præsenteres her, vil hjælpe os med at studere HBV-infektion i ikke-levercellelinjer.
Introduction
Hepatitis B påvirker livet for mere end 2 milliarder mennesker og er en af de største trusler mod folkesundheden. Omkring 257 millioner mennesker er kronisk inficeret med hepatitis B-virus (HBV) på verdensplan, hvilket medfører en stor byrde for samfundet1. Hepatocytter er ikke de eneste celler inficeret med HBV og andre celler i ikke-levervæv, såsom nyre og testiker, er også inficeret med denne virus2,3. I øjeblikket, HBV infektion cellemodeller er begrænset til humane hepatocytter med kun få ikke-hepatisk celle linje modeller. Dette hæmmer studiet af HBV-infektion og HBV-relateret patologi af ikke-levervæv. Her præsenterer vi protokoller for at studere HBV-infektion i ikke-lever 293T celler samt i hepatoma-baserede celler.
Natrium taurocholate co-transport polypeptid (NTCP) er en funktionel receptor for human hepatitis B og hepatitis D virus4. Hepatocyt nuklear faktor 4α (HNF4α), retinoid X receptor α (RXRα) og peroxisome proliferator-aktiveret receptor α (PPARα) er leverberigede transskriptionsfaktorer, der begrænser viral tropisme i HBV. De er blevet verificeret for at fremme HBV pregenomic RNA syntese og støtte HBV replikation i en nonhepatoma cellelinje5. Vi konstrueret tre forskellige cellelinjer, HepG2 cellelinjer udtrykker NTCP (HepG2-NE), 293T cellelinje udtrykker NTCP (293T-NE) og 293T cellelinje udtrykke fire vært gener; NTCP, HNF4α, RXRα og PPARα (293T-NE-3NRs). Der blev udviklet to metoder til HBV-infektion baseret på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den første metode anvender vaccination i 293T-NE-3NRs med høj viral genomækvivalens (høj GEq (150), DMSO og PEG8000) i 24 timer. Den anden metode anvender co-dyrkning 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan producere HBV partikler (lav GEq (ca. 1,83) uden DMSO og PEG8000), og dermed tæt efterligne naturlige forhold.
HepG2.2.15 celler er afledt af HepG2 linje og kronisk udskiller infektiøse HBV, samt subvirale partikler i kulturmediet6,7. Cyclosporin A (CsA) er et immunhæmmende middel, der anvendes klinisk til undertrykkelse af xenograftafstødning. Undersøgelser har vist, at CsA hæmmer HBV’s indtræden i dyrkede hepatocytter ved at hæmme NTCP’s transportaktivitet og blokere bindingen af NTCP til store kuvertproteiner8.
HepG2-NE-celler blev anvendt som positiv kontrol, mens CsA-behandlede celler blev anvendt som negativ kontrol. Ved at sammenligne med de positive og negative kontrolgrupper kan vi finde ud af, hvilke værtsgener der spiller en afgørende rolle i HBV-infektion. Derudover, gennem denne form for HBV infektion, kan vi også finde andre nye mekanismer eller vært gener involveret i HBV infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introducerer vi protokoller for HBV-infektion i ikke-lever 293T-NE-3NRs og hepatoma-baserede HepG2-NE-celler. 293T-NE-3NR’er var egnede til HBV-infektion ved både høj og lav GEq. Følgende kritiske trin skal tages i betragtning, når du bruger vores protokol. Cellestatus er en vigtig faktor for en vellykket infektion. Infektionsmediet skal skiftes rettidigt efter den indledende periode med HBV-infektion. 293T-NE-3NRs celler er typisk skrøbelige efter infektion med høje virale titere. Derfor skal disse celler vask…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81870432 og 81570567 til X.L.Z.), (nr. 81571994 til P.N.S.), Research Fund for International Young Scientists (nr. 81950410640 til W.I.); Li Ka Shing Shantou University Foundation (Nr. L1111 2008 til P.N.S.). Vi vil gerne takke prof. Stanley Lin fra Shantou University Medical College for nyttige råd.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
