Modellering hepatit B virusinfektion i icke-lever 293T-NE-3NRs Celler
Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för hepatit B-virus (HBV) infektion i nya konstruerade 293T celler (293T-NE-3NRs, uttrycker mänskliga NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα) och traditionella leverceller (HepG2-NE, uttrycker mänskliga NTCP).
Abstract
HBV infekterar främst mänskliga hepatocyter, men det har också visat sig infektera extrahepatic vävnader såsom njure och testikel. Icke desto mindre, cell-baserade HBV modeller är begränsade till hepatoma cellinjer (såsom HepG2 och Huh7) överuttryck en funktionell HBV receptor, natrium taurocholat samtransport polypeptid (NTCP). Här använde vi 293T-NE-3NRs (293T overexpressing human NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα) och HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) som modellcelllinjer. HBV infektion i dessa cellinjer utfördes antingen med hjälp av koncentrerade HBV virus partiklar från HepG2.2.15 eller co-odling HepG2.2.15 med målet cellinjer. HBcAg immunofluorescens för HBcAg utfördes för att bekräfta HBV infektion. De två metoder som presenteras här kommer att hjälpa oss att studera HBV infektion i icke-lever cellinjer.
Introduction
Hepatit B påverkar livet för mer än 2 miljarder människor och är ett av de största hoten mot folkhälsan. Cirka 257 miljoner människor är kroniskt smittade med hepatit B-virus (HBV) över hela världen, vilket orsakar en stor börda för samhället1. Hepatocyter är inte de enda celler som smittats av HBV och andra celler i icke-levervävnad, såsom njure och testikel, är också smittade av detta virus2,3. För närvarande HBV infektion cellmodeller är begränsade till mänskliga hepatocyter med endast några icke-lever celllinje modeller. Detta hämmar studien av HBV-infektion och HBV-relaterad patologi av icke-levervävnader. Här presenterar vi protokoll för att studera HBV infektion i icke-lever 293T celler samt i hepatoma-baserade celler.
Natriumtaurocholate co-transporterar polypeptid (NTCP) är en funktionell receptor för human hepatit B och hepatit D-virus4. Hepatocyte nukleära faktor 4α (HNF4α), retinoider X receptor α (RXRα) och peroxisome proliferator-aktiverad receptor α (PPARα) är leverberikade transkriptionsfaktorer som begränsar viral tropism av HBV. De har verifierats för att främja HBV pregenomisk RNA-syntes och stödja HBV-replikering i en nonhepatoma cellinje5. Vi konstruerade tre olika cellinjer, HepG2 cellinjer uttrycker NTCP (HepG2-NE), 293T cellinje uttrycker NTCP (293T-NE) och 293T cellinje uttrycker fyra värdgener; NTCP, HNF4α, RXRα och PPARα (293T-NE-3NRs). Två metoder för HBV-infektion utvecklades baserat på 293T-NE-3NRs (figur 1). Den första metoden använder inympning i 293T-NE-3NRs med hög viral genomekvivalens (hög GEq (150), DMSO och PEG8000) för 24 h. Den andra metoden använder co-odling 293T-NE-3NRs med HepG2.2.15, som kan producera HBV partiklar (låg GEq (ca 1,83) utan DMSO och PEG8000), vilket nära efterliknar naturliga förhållanden.
HepG2.2.15 celler kommer från HepG2 linjen och kroniskt utsöndr infektiös HBV, samt subvirala partiklar i odlingsmediet6,7. Cyclosporin A (CsA) är ett immunsuppressivt kliniskt används för undertryckande av xenograft avslag. Studier har visat att CsA hämmar HBV inträde i odlade hepatocyter genom att hämma transportören verksamhet NTCP och blockerar bindning av NTCP till stora kuvert proteiner8.
HepG2-NE celler användes som positiv kontroll medan CsA behandlade celler användes som negativ kontroll. Genom att jämföra med de positiva och negativa kontrollgrupperna kan vi ta reda på vilka värdgener som spelar en avgörande roll i HBV-infektion. Dessutom, genom detta läge av HBV infektion, kan vi också hitta andra nya mekanismer eller värd gener som deltar i HBV infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar vi protokoll för HBV infektion i icke-lever 293T-NE-3NRs och hepatoma-baserade HepG2-NE celler. 293T-NE-3NR var lämpliga för HBV-infektion vid både hög och låg GEq. Följande kritiska åtgärder måste beaktas när du använder vårt protokoll. Cellstatus är en viktig faktor för en lyckad infektion. Infektionsmediet måste ändras i tid efter den inledande perioden av HBV-infektion. 293T-NE-3NRs celler är vanligtvis bräckliga efter infektion med hög viral titers. Därför måste dessa celler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 81870432 och 81570567 till X.L.Z.), (nr 81571994 till P.N.S.), Forskningsfonden för internationella unga forskare (nr 81950410640 till W.I.); Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 till P.N.S.). Vi vill tacka prof. Stanley Lin från Shantou University Medical College för användbara råd.
Materials
| 0.45μm membrane filter | Millex-HV | SLHU033RB | Filter for HepG 2.2.15 supernatant |
| 293T-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 293T-NE-3NRs | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| 594 labeled goat against rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For immunofluorescence assay,second antibody |
| 6-well plate | BIOFIL | TCP010006 | For co-culture |
| Amicon Ultra 15 ml | Millipore | UFC910008 | For concentration of HepG 2.2.15 supernatant |
| BSA | Beyotime | ST023 | For immunofluorescence assay |
| Cyclosporin A | Sangon biotech | 59865-13-3 | inhibitor of HBV infection |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| Diagnostic kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA(PCR-Fluorescence Probing) | DAAN GENE | 7265-2013 | For HBV DNA detection |
| DMEM | HyClong | SH30243.01 | For culture medium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For improvement of infection efficiency |
| Fetal bovine serum（FBS） | CLARK Bioscience | FB25015 | For culture medium |
| Fluorescence microscope | ZEISS | Axio observer Z1 | For immunofluorescence assay |
| HepG2-NE | Laboratory construction | —— | Cell model for HBV infection |
| HBcAg antibody | ZSGB-BIO | ZA-0121 | For immunofluorescence assay, primary antibody |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | For cell wash |
| PEG8000 | Merck | P8260 | For infection medium |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Thermo Fisher | 10378016 | For culture medium |
| Transwell | CORNING | 3412 | For co-culture |
| Tween 20 | sigma-Aldrich | WXBB7485V | For PBST |
| Virkon | Douban | 6971728840012 | Viruside |
References
- World Health Organization. Global hepatitis report, 2017. World Health Organization. , (2017).
- Yoffe, B., Burns, D. K., Bhatt, H. S., Combes, B. Extrahepatic hepatitis B virus DNA sequences in patients with acute hepatitis B infection. Hepatology. 12, 187-192 (1990).
- Mason, A., Wick, M., White, H., Perrillo, R. Hepatitis B virus replication in diverse cell types during chronic hepatitis B virus infection. Hepatology. 18, 781-789 (1993).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. eLife. 1, 00049 (2012).
- Tang, H., McLachlan, A. Transcriptional regulation of hepatitis B virus by nuclear hormone receptors is a critical determinant of viral tropism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 1841-1846 (2001).
- Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 1005-1009 (1987).
- Sells, M. A., Zelent, A. Z., Shvartsman, M., Acs, G. Replicative intermediates of hepatitis B virus in HepG2 cells that produce infectious virions. Journal of Virology. 62, 2836-2844 (1988).
- Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59, 1726-1737 (2014).
- Yang, X., et al. Defined host factors support HBV infection in non-hepatic 293T cells. Journal of Cell and Molecular Medicine. 24, 2507-2518 (2020).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Ortega-Prieto, A. M., Cherry, C., Gunn, H., Dorner, M. In Vivo Model Systems for Hepatitis B Virus Research. ACS Infectious Diseases. 5, 688-702 (2019).
- Liang, T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 49, 13-21 (2009).
- Nie, Y. Z., et al. Recapitulation of hepatitis B virus-host interactions in liver organoids from human induced pluripotent stem cells. EBioMedicine. 35, 114-123 (2018).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15, 613-624 (2019).
