Impianto di stent coronari di dimensioni umane nell'aorta addominale del ratto utilizzando un accesso trans-femorale
Summary
Questo protocollo descrive l’impianto di stent coronari umani nell’aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale. Rispetto ad altri modelli animali, i modelli murini portano i vantaggi di alta produttività, riproducibilità, facilità di movimentazione e alloggiamento e un’ampia disponibilità di marcatori molecolari.
Abstract
L’intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l’impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica. La restenosi in-stent (ISR) è determinata da un’eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all’interno dello stent e limita il successo a lungo termine degli stent. Una varietà di modelli animali sono stati utilizzati per chiarire i processi fisiopatologici alla base della restenosi in-stent (ISR), con i modelli coronarica suina e l’arteria iliaca del coniglio che sono i più frequentemente utilizzati. I modelli murini offrono i vantaggi di un’elevata produttività, facilità di movimentazione e alloggiamento, riproducibilità e un’ampia disponibilità di marcatori molecolari. Il modello di topo carente di apolipoproteina E (apoE-/- ) è stato ampiamente utilizzato per studiare le malattie cardiovascolari. Tuttavia, gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, comportando importanti cambiamenti delle loro proprietà meccaniche e (potenzialmente) biologiche. L’uso di ratti apoE-/- può superare queste carenze in quanto i ratti apoE-/- consentono la valutazione degli stent coronari delle dimensioni dell’uomo e allo stesso tempo forniscono un fenotipo aterogenico. Questo li rende un modello eccellente e affidabile per indagare ISR dopo l’impianto stent. Qui descriviamo, in dettaglio, l’impianto di stent coronari umani disponibili in commercio nell’aorta addominale dei ratti con uno sfondo apoE-/- utilizzando un accesso trans-femorale.
Introduction
L’intervento coronarica percutaneo (PCI), combinato con l’impiego di uno stent coronarica, rappresenta il gold standard nel trattamento interventico della malattia coronarica1. Il successo a lungo termine degli stent, tuttavia, può essere limitato dal verificarsi di restenosi in-stent (ISR) determinata da un’eccessiva proliferazione del tessuto neointimico all’interno dello stent2,3. L’ISR può richiedere un nuovo intervento con bypass coronarica o re-PCI. Per lo studio dell’ISR sono stati suggeriti diversi modelli animali, ognuno dei quali presenta vantaggi e carenze. I principali inconvenienti dei modelli di arteria iliaca suina più comunemente usati e del coniglio iliaca, sebbene sviluppino lesioni marcatamente simili all’uomo dopo l’impianto di stent4,5, sono grandi costi animali e abitativi che sollevano difficoltà logistiche soprattutto negli studi a lungo termine, nonché limitazioni nella manipolazione e nelle attrezzature. Inoltre, la disponibilità di anticorpi contro le proteine cellulari di suini e conigli è limitata. D’altra parte, i modelli murini offrono i principali vantaggi di elevata produttività e riproducibilità, nonché facilità di movimentazione, alloggiamento e quindi economicità. Inoltre, è disponibile un numero maggiore di anticorpi. Tuttavia, mentre i topi apolipoproteina E-carenti (apoE-/-) sono stati ampiamente utilizzati per lo studio dell’aterosclerosi6,7,8, non sono adatti allo studio dell’ISR poiché gli stent devono essere miniaturizzati per essere impiantati nei topi, potenzialmente cambiando le proprietà meccaniche degli stent. Inoltre, la parete aortica dei topi misura tra 50 μm nei giovani topi e 85 μm nei vecchitopi 9e gli stent devono essere utilizzati utilizzando livelli di pressione fino a 2 atm, che potrebbero portare alla malapposizione dello stent10. I ratti, tuttavia, consentono l’impianto di stent coronari umani disponibili in commercio e dimostrano un corso di guarigione vascolare simile agli animali più grandi dopo l’impianto di stent aortico, riportato per la prima volta da Langeveld etal. Questa tecnica originariamente richiedeva un accesso trans-addominale, che richiedeva una costrizione fisica dell’aorta per ottenere un’interruzione temporanea del flusso sanguigno. Per evitare la lesione del vaso potenzialmente associata e le reazioni infiammatorie, la tecnica è stata successivamente perfezionata con l’introduzione di un accesso trans-iliaca, che ha inoltre portato a un più alto tasso di sopravvivenza degli animali12.
Poiché i ratti di tipo selvatico non sviluppano lesioni aterosclerotiche13, i ratti apoE-/- sono stati generati utilizzando tecniche di nucleasi come transcription activator-like Effector Nuclease (TALEN)14, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9)15e Zinc Finger (ZF)16. I ratti ApoE-/- sono disponibili in commercio dal 2011. Fornendo uno sfondo aterogenico, i ratti apoE-/- consentono una valutazione più realistica degli stent coronari a misura d’uomo, in particolare per quanto riguarda l’ISR.
Nel presente documento, descriviamo il metodo attraverso la via di accesso transfemorale e utilizzando uno stent di eluizione del farmaco cobalto-cromo (DES) a punto sottile disponibile in commercio, tuttavia, può anche essere applicato per lo studio di altri tipi di stent, come stt bare metal (BMS) o stent biodegradabili.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive l’impianto di stent coronari a misura d’uomo nell’aorta addominale dei ratti apoE-/- . Vale la pena sottolineare diversi punti tecnici. In primo luogo, si dovrebbe evitare una mancata corrispondenza tra la dimensione dello stent e la dimensione dell’aorta. Posizionare uno stent troppo piccolo può portare a malapposition stent, mentre l’impianto di uno stent troppo grande per l’aorta può causare sovraccarico, strappo e lesioni del vaso. Pertanto, si consiglia di utilizzare stent tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la signora Angela Freund per la sua preziosa assistenza tecnica nella produzione di incorporamenti e diapositive. Ringraziamo anche Tadeusz Stopinski presso l’Institute for Laboratory Animal Science & Experimental Surgery per il suo perspicoso aiuto nel lavoro veterinario.
Materials
| Diet | |||
| SNIFF High Fat diet + Clopidogrel (15 mg/kg) | SNIFF Spezialdiäten GmbH, Soest | custom prepared | Western Diet |
| Drugs and Anesthetics | |||
| Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | |
| ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
| Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
| Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
| Ringer's lactate solution | Baxter Deutschland GmbH | 3775380 | |
| (S)-ketamine | CEVA Germany | ||
| Xylazine | Medistar Germany | ||
| Consumable supplies | |||
| 10 mL syringes | BD Plastipak | 4606108V | |
| 2 mL syringes | BD Plastipak | 4606027V | |
| 6-0 prolene suture | ETHICON | N-2719K | |
| 4-0 silk suture | Seraflex | IC 158000 | |
| Bepanthen Eye and Nose Ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
| Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
| Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
| Poly-Alcohol Skin Desinfection Solution | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
| Sterican needle 18 G | B. Braun | 304622 | |
| Sterican needle 27 3/4 G | B.Braun | 4657705 | |
| Tissue Paper | commercially available | ||
| Surgical instruments | |||
| Graefe forceps curved x1 | Fine Science Tools Inc. | 11151-10 | |
| Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
| Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
| Scissors | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
| Semken forceps | Fine Science Tools Inc. | 11008-13 | |
| Small surgical scissors curved | Fine Science Tools Inc. | 14029-10 | |
| Small surgical scissors straight | Fine Science Tools Inc. | 14028-10 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools Inc. | 11000-12 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools Inc. | 15000-08 | |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Leica MZ9 | ||
| Temperature controlled heating pad | Sygonix | 26857617 | |
| Equipment for stent implantation | |||
| Drug-eluting stent Xience 2,25mm x 8mm | Abbott Vascular USA | 1009544-18 | |
| Guide wire Fielder XT PTCA guide wire: 0.014" x 300cm | ASAHI INTECC CO., LTD Japan | AGP140302 | |
| Inflation syringe system | Abbott 20/30 Priority Pack | 1000186 | |
| Tissue processing and analysis | |||
| 30% H2O2 | Roth | 9681 | Histology |
| Ethanol | Roth | K928.1 | Histology |
| Giemsas Azur-Eosin-Methylenblau | Merck | 109204 | Histology |
| Graphic Drawing Tablet | WACOM Europe GmbH | CTL-6100WLK-S | |
| Roti Histofix, Formaldehyd 4% buffered | Roth | P087 | Histology |
| Technovit 9100 | Morphisto | 12225.K1000 | Histology |
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