Visualisierung der DNA-Reparaturproteine Interaktion durch Immunfluoreszenz

Zusammenfassung

Nach DNA-Schäden aktivieren menschliche Zellen wichtige Reparaturwege, um die Integrität ihres Genoms wiederherzustellen. Hier beschreiben wir die Methode der indirekten Immunfluoreszenz als Mittel, um DNA-Reparaturproteine zu erkennen, ihre räumliche und zeitliche Rekrutierung zu analysieren und die Protein-Protein-Interaktion an den Stellen von DNA-Schäden zu begutachten.

Zusammenfassung

Säugetierzellen sind ständig Chemikalien, Strahlungen und natürlich vorkommenden metabolischen Nebenprodukten ausgesetzt, die bestimmte Arten von DNA-Beleidigungen erzeugen. Genotoxische Wirkstoffe können das DNA-Rückgrat beschädigen, es brechen oder die chemische Natur einzelner Basen verändern. Nach DNA-Beleidigung werden DNA-Schadensreaktionen (DDR) aktiviert und an der Reparatur beteiligte Proteine rekrutiert. Eine Vielzahl von Faktoren sind beteiligt, um die Art des Schadens zu erfassen und die entsprechende Reparaturreaktion zu aktivieren. Wenn DDR-Faktoren nicht richtig aktiviert und rekrutiert werden, kann dies zu genomischer Instabilität führen, die vielen menschlichen Pathologien einschließlich Krebs zugrunde liegt. Studien mit DDR-Proteinen können Einblicke in die genotoxische Arzneimittelreaktion und zelluläre Mechanismen der Arzneimittelresistenz liefern.

Es gibt zwei Hauptmethoden zur Visualisierung von Proteinen in vivo:direkte Beobachtung, indem das Protein von Interesse mit einem fluoreszierenden Protein getagt und ihm durch Live-Bildgebung oder indirekte Immunfluoreszenz auf festen Proben folgt. Während die Visualisierung fluoreszierender Proteine eine präzise Überwachung im Laufe der Zeit ermöglicht, kann die direkte Kennzeichnung in N- oder C-Terminus die Proteinlokalisierung oder -funktion beeinträchtigen. Die Beobachtung von Proteinen in ihrer unveränderten, endogenen Version wird bevorzugt. Wenn DNA-Reparaturproteine zur DNA-Beleidigung rekrutiert werden, erhöht sich ihre Konzentration lokal und sie bilden Gruppen oder "Foci", die durch indirekte Immunfluoreszenz mit spezifischen Antikörpern visualisiert werden können.

Obwohl der Nachweis von Proteinschwerpunkten keinen endgültigen Beweis für eine direkte Wechselwirkung liefert, weist die Kolokalisierung von Proteinen in Zellen darauf hin, dass sie sich an die Schadensstelle gruppieren und über die Abfolge der Ereignisse informieren können, die für eine komplexe Bildung erforderlich sind. Eine sorgfältige Analyse der räumlichen Überlappung von Brennpunkten in Zellen, die Wildtyp- oder mutierte Versionen eines Proteins exdrücken, kann wertvolle Hinweise auf funktionelle Domänen liefern, die für die DNA-Reparaturfunktion wichtig sind. Schließlich weist die Kolokalisierung von Proteinen auf mögliche direkte Wechselwirkungen hin, die durch Ko-Immunpräzipation in Zellen oder direkten Pulldown mit gereinigten Proteinen verifiziert werden können.

Einleitung

Menschliche Zellen sind ständig einer Vielzahl von DNA-schädigenden Wirkstoffen unterschiedlicher Herkunft ausgesetzt. Exogene Quellen bestehen hauptsächlich aus der Exposition gegenüber Strahlungen, Chemikalien (einschließlich Chemotherapeutika und einigen Antibiotika) und Viren, während die wichtigsten endogene Quellen Fehler bei der DNA-Replikation und oxidativem Stress umfassen. Die direkten Auswirkungen einer genotoxischen Exposition können je nach Stress und Expositionsdosis von einer modifizierten Basis bis hin zu einem potenziell tödlichen DNA-Doppelstrangbruch (DSB) reichen. Letztlich können nicht reparierte oder falsch reparierte DNA-Schäden zur Anhäufung vo....

Protokoll

1. HeLa Zellkultur

1. Rundglasabdeckungen mit 1 M HCl bei 50 °C für 16-18 Stunden vorbehandeln. Mit ddH₂O abspülen und in 100% EtOH lagern.
2. Zellkulturmedium vorbereiten: 10% (v/v) FBS zu DMEM medium hinzufügen.
3. 4,0 x 10⁴ Zellen/gut in steriler 12-Well-Platte mit einem 18 mm runden Glasdeckel bei 37 °C und 5%_CO2 in einem befeuchteten Inkubator anbauen. Wachsen Sie Zellen bis zu 80% Koninfluenza (ca. 24 Stunden).

2. Zellbehandlung mit Strahlung (IR)

1. Um die Bildung von Doppelstrangbrüchen zu induzieren, setzen Sie die Zellen einer 4 Gy-Bestrahlung aus (Kontrolle: Keine....

Ergebnisse

Am Tag 2 oder 24 h nach der Aussaat von Zellen auf Deckellips haben die Zellen eine Teilung durchlaufen und sind zu 80% konfluent. Spezifische Knockdowns oder Mutationen in DNA-Reparaturproteinen können die Verdoppelungszeit erhöhen oder Zellen für eine genotoxische Behandlung sensibilisieren, und die Saatdichte sowie die Behandlungsdosen sollten entsprechend angepasst werden. Um die besten Arbeitsbedingungen zu bestimmen, kann der Zeitpunkt der Reaktion auf DNA-Schäden durch Western-Blotting von H2AX im Laufe der Zeit e.......

Diskussion

Die Analyse des Timings und der Effizienz der Reparatur von DNA-Schäden durch Mikroskopie hat sich als wesentlich erwiesen, um zu verstehen, wie die DNA-Reparaturmaschinerie funktioniert, in normalen Zellen und in menschlichen Pathologien wie Krebs.

Die Entwicklung spezifischer Antikörper, die den Nachweis aktivierter Proteine in ihrer phosphorylierten Version ermöglichen (z. B. H2AX, pRPA, pRAD50 und andere^10,23,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 % (v/v) Paraformaldehyd (PFA) wässrige Lösung	Elektronenmikroskopie Sciences	15710	Die Mikroskopiequalität des PFA sorgt für beste Bilder. Bei Verwendung von "hausgemachtem PFA" vor Gebrauch filtern.
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	wird eine Hitzeschockfraktion empfohlen, um Niederschlag/Hintergrund zu vermeiden.
Deckglas #1, 18 mm rund (Deckgläser)	Neuvitro	NC0308920	Deckgläser müssen vor der Verwendung mit HCl oder Ethanol gereinigt und sterilisiert werden.
DMEM, hoher Glukosegehalt [(+) 4,5 g/L D-Glukose, (+) L-Glutamin, (-) Natriumpyruvat]	Gibco	11965118	Passen Sie das Kultursubstrat an die Bedürfnisse der verwendeten Zelllinie an.
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190144	PBS für die Gewebekultur.
Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N&prim;,N′-tetraessigsäure (EGTA)	Research Products International	E57060	Puffer für die nukleare Extraktion.
Fötales Rinderserum (FBS)	Life Technologies	104370028	Die Qualität von FBS kann durch Testen der Bildung von gH2AX-Herden beurteilt werden. Wenn Spuren von genotoxischem Endotoxin in der Charge vorhanden sind, ist gH2AX ohne Stress positiv.
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Research Products International	M24000	Nuklearer Extraktionspuffer.
Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuklearer Extraktionspuffer.
Stattdessen kann SlowFade Diamond Antifade Eindeckmittel mit DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI mit VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium verwendet werden.
Natriumchlorid (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuklearer Extraktionspuffer.
Saccharose	Research Products International	S24060	Nuklearer Extraktionspuffer.
Superfrost Plus Objektträger	Fisherbrand	1255015	Polysine Objektträger können stattdessen verwendet werden.
TC-behandelte Mehrfach-Well-Platten, Größe 12 Wells	Costar	3513	Die Aussaat auf Deckgläsern erfolgt in 12-Well-Platten.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Extraktionspuffer für Kernkraftwerke.
Stattdessen kann TrypLE Express Enzyme (1X), kein Phenolrot,	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA verwendet werden.
Stattdessen kann Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot	Gibco	15400054	TrypLE verwendet werden.

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