Инъекция гидрогелевых биоматериальных каркасов в мозг после инсульта

Summary

Инсульт является глобальной проблемой с минимальными вариантами лечения и отсутствием текущей клинической терапии для регенерации потерянной ткани мозга. Здесь описаны методы создания точного фототромботического инсульта в моторной коре грызунов и последующего введения гидрогелевых биоматериалов для изучения их влияния на регенерацию тканей после инсульта.

Abstract

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими инсультами и определяются как внезапная закупорка сосуда, снабжающего кровью мозг. В течение нескольких минут после блокировки клетки начинают умирать и приводить к непоправимому повреждению тканей. Современные терапевтические методы лечения сосредоточены на удалении сгустков или лизисе, чтобы обеспечить реперфузию и предотвратить более серьезное повреждение головного мозга. Хотя преходящая пластичность мозга может со временем спасти часть поврежденной ткани, значительная часть пациентов остается с неврологическим дефицитом, который никогда не разрешится. Существует нехватка терапевтических возможностей для лечения неврологического дефицита, вызванного инсультом, что подчеркивает необходимость разработки новых стратегий лечения этой растущей популяции пациентов. Инъекционные биоматериалы в настоящее время разрабатываются для повышения пластичности мозга и улучшения эндогенного восстановления за счет доставки активных агентов или стволовых клеток. Одним из методов проверки этих подходов является использование модели инсульта грызунов, введение биоматериала в ядро инсульта и оценка восстановления. Знание точного местоположения ядра инсульта является обязательным для точного лечения после инсульта, поэтому модель инсульта, которая приводит к предсказуемому расположению инсульта, предпочтительнее, чтобы избежать необходимости визуализации до инъекции. Следующий протокол будет охватывать, как вызвать фототромботический инсульт, как вводить гидрогель контролируемым и точным образом, а также как извлекать и криосекционировать мозг, сохраняя биоматериал нетронутым. Кроме того, мы расскажем, как эти же гидрогелевые материалы могут быть использованы для совместной доставки стволовых клеток. Этот протокол может быть обобщен на использование других инъекционных биоматериалов в сердцевину инсульта.

Introduction

Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах^1. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими, в то время как большинство из оставшихся 13% являются геморрагическими^2. Ишемический инсульт определяется как закупорка кровотока в артерии к окружающим тканям. Эта окклюзия приводит к кислородному голоданию и последующему некрозу, что часто приводит к постоянной инвалидности у выживших пациентов. Несмотря на снижение смертности от инсульта^3,ожидается, что к 2030 году его распространенность возрастет до 3,4 млн^{человек4.} Это увеличение числа выживших инвалидов и последующее экономическое бремя привели к толчку к исследованиям инсульта, которые сосредоточены на механизмах восстановления нейронов. После инсульта возникает воспалительный период, который приводит к образованию рубца, препятствующего расширению некротической области. Область, окружающая некротическое ядро, называется «периинфарктом», и есть убедительные доказательства того, что пластичность в этой области, которая включает в себя повышенный ангиогенез, нейрогенез и аксональное прорастание, напрямую связана с наблюдаемым восстановлением у животных моделей и людей^5. Поскольку не существует моделей in vitro, которые могут правильно воспроизвести сложные взаимодействия после инсульта, животные модели необходимы для исследований инсульта.

Существует несколько моделей in vivo, которые могут быть использованы для получения ишемического инсульта. Одной из наиболее распространенных моделей, используемых у мышей, является окклюзия средней мозговой артерии, или MCAo, через дистальную или проксимальную (через внутриартериальную нить) окклюзию. Проксимальная модель, также известная как нить MCAo (fMCAo), обычно приводит к большим ишемическим инсультам, которые охватывают от 5% до 50% полушария головного мозга, в зависимости от количества факторов^6. В этих моделях шов или нить продвигается от внутренней сонной артерии к основанию средней мозговой артерии (MCA) и удерживается на месте в течение определенного периода времени. Этот метод окклюзии, который может быть сделан временным или постоянным, вызывает инфаркт, который сосредоточен в полосатом теле и может включать или не включать вышележащую кору^6. Результирующий размер удара сильно варьируется, и методы визуализации, такие как лазерная допплерография, необходимы для подтверждения эффективности процедуры у каждой мыши. Внутриартериальная или внутрисветная окклюзия нити, которая длится более 30 минут, вызывает инсульты на большем конце диапазона размеров. Некоторые исследователи сосредоточились на более коротком времени окклюзии нити, которое требует значительного экспериментального фокуса и лабораторной^{проверки 7.} Модели MCAo нити у мышей следуют аналогичным стадиям гибели клеток, ишемической прогрессии и формирования периинфарктной области, как это наблюдается в случаях инсульта у человека; однако более крупные инсульты более близко напоминают болезненное состояние злокачественных инфарктов головного мозга, которые являются менее распространенными, менее излечимыми инсультами человека^6. Между тем, дистальная окклюзия MCA требует более сложной операции и краниэктомии. В этой модели дистальная часть MCA, которая проходит вдоль поверхности мозга, непосредственно закупоривается шовным галстуком или прижиганием. В некоторых вариациях методики сонные артерии закупориваются односторонне или временно-двусторонне. Преимущество дистального MCAo заключается в том, что он производит кортикальный инсульт, который менее изменчив по размеру, чем модель нити. Тем не менее, дистальная модель производит более плохой поведенческий выход из-за трансекции наружной сонной артерии (ECA), что также является проблемой для fMCAo^6.

Альтернативной моделью инсульта, которая известна своей менее инвазивной, является фототромботическая (PT) модель. Модель PT приводит к четко определенному местоположению ишемии и связана с высокой выживаемостью^8. Методика опирается на светочувствительный краситель, вводимый внутрибрюшинно, который позволяет осуществлять внутрисосудистое фотоокисление просто путем облучения желаемой ткани светом или лазером^9. При возбуждении образуются кислородные радикалы, вызывающие повреждение эндотелия, что активирует агрегацию тромбоцитов и образование сгустков в облученной^{области 8,9.} Жесткий контроль над размером и расположением штриха, а также высокая воспроизводимость модели PT делают ее идеальной для изучения биоматериалов. Хотя точность становится возможной с помощью лазерных и стереотаксических координат, есть некоторые недостатки, которые могут сделать эту модель менее идеальной для нескольких исследований. В отличие от модели fMCAo, модель удара PT не может быть реперфузирована. Поэтому материалы для исследования нейропротекторных средств, специфичных для повреждений после реперфузии или механизмов после реперфузии, не были бы полезны здесь^8. Кроме того, из-за микрососудистого повреждения модели PT наблюдается относительно небольшая ишемическая полутень. Вместо этого возникает локальный вазогенный отек, что нехарактерно для инсульта человека, что делает эту модель нежелательной для доклинических исследований лекарств, ориентированных на периинфарктную^{область 6,8.}

Общая цель стратегий биоматериала при инсульте заключается в том, чтобы либо доставить биологически активные агенты, либо действовать как суррогатный внеклеточный матрикс для роста ткани мозга. Одна из стратегий, которую мы будем изучать с использованием наших методов, заключается в доставке гидрогеля непосредственно в ядро инсульта, в отличие от ткани периинфаркта, где многие современные клеточные терапии доставляются^10. Обоснование этого подхода заключается в том, что доставка в некротическую ткань, обнаруженную в ядре, позволит избежать нарушения окружающей здоровой или восстанавливающейся ткани. Мы предполагаем, что диффузия любых активных агентов, входящих в состав биоматериала, сможет достичь периинфаркта из ядра, тем более что мы обнаруживаем, что доставка биоматериалов гидрогеля уменьшает толщину глиального рубца^11. Это важно, поскольку было показано, что периинфарктная область демонстрирует нейропластичность после инсульта, что делает ее привлекательной мишенью. Кроме того, доставка суррогатной матрицы к инсультному ядру может быть загружена ангиогенными¹² или нейрогенными¹³ факторами для руководства образованием новой ткани, а также клеток для доставки^14. Доставка клеток значительно улучшается за счет использования матрицы, поскольку она защищает клетки от жестких сил инъекции и локальной среды, присутствующих во время доставки, а также способствует дифференцировке и приживлению^15.

Эти инъекционные терапевтические биоматериалы имеют клиническое значение в приложениях для лечения инсульта, поскольку в настоящее время нет медицинских методов лечения, которые стимулируют восстановление нейронов после инсульта. Основные нейронные цепи, участвующие в восстановлении, лежат в ткани мозга, которая примыкает к ядру инсульта^16,в то время как само ядро инсульта лишено жизнеспособной нервной ткани. Мы ожидаем, что доставка биоматериала в ядро некротического инсульта имеет потенциал для стимуляции прилегающей ткани к регенеративным процессам с помощью ряда ранее упомянутых механизмов, включая депо высвобождение факторов роста^13,стимуляцию роста тканей и содействие развитию восстанавливающейся ткани мозга^11,12,изменение иммунных реакций¹⁷и доставку терапевтических средств, полученных из стволовых клеток^{14, 18}. Однако для эффективного изучения возможности этих применений необходим последовательный и воспроизводимый метод индуцирования инсульта и инъекций биоматериалов. Модель обводки PT использует методы, которые обеспечивают точный контроль над ориентацией и местоположением штриха. Лазер, прикрепленный к стереотаксическому устройству, направляет ориентацию, а насосы, прикрепленные к стереотаксическим устройствам, контролируют скорость впрыска материала без необходимости дополнительных форм визуализации. Поэтому мы решили описать методы выполнения инсульта ПТ в моторной коре мышей и для введения биоматериалов в ядро инсульта. Здесь мы используем микропористые отожженные частицы (MAP) гидрогели в качестве биоматериала для инъекций без добавления клеток или факторов роста. Кроме того, мы объясняем, как успешно извлечь мозг с неповрежденным биоматериалом, и мы обсуждаем иммунохимические анализы, используемые для анализа результатов инсульта с инъекцией биоматериалов и без нее.

Protocol

Эксперименты проводились в соответствии с IUCAC в Университете Дьюка и Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. В этом исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель. Животные содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-?…

Representative Results

Целью этого метода была демонстрация того, как вводить биоматериалы в мозг после инсульта. Фототромботическая модель с розовой бенгальской розой и лазером 520 нм использовалась для контролируемой ориентации поражений инсульта как по размеру, так и по местоположению. Через пять дней пос…

Discussion

Здесь мы демонстрируем легко воспроизводимую, минимально инвазивную, постоянную модель инсульта и описываем, как ввести биоматериал в инфаркт через пять дней после инсульта. Использование фототромботического красителя Rose Bengal и коллимированного лазера 520 нм, подключенного к стереотак…

Materials

10% Normal Goat Serum	VWR	100504-028	For blocking buffer
2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium	Medline	MDS090735
25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle	Fishcer Scientific	14824663	Syringes used to inject biomaterials
25uL Positive displacement pipette	Gilson	M-25
2x Beam Expander, 400-650nm	Thorlabs	GBE02-A	Laser beam expander
Adjustable Stage Platform	Kopf Instruments	901
Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit	Abcam	ab113435
Anti-Iba1 Antibody, goat	abcam	ab5076
BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12"	Medsupply	367294	For perfusions
BKF12- Matte Black Aluminum Foil	Thorlabs	BKF12	To cover anything that is reflective when using laser.
Bone Iris Mini Scissors – 3-1/2"	Sklar surgical instruments	64-2035
C57BL/6 Mice	Jackson Laboratory	000664	8-12 weeks of age
Cage Assembly Rob	Thorlabs	ER3-P4	3" Long, diameter 6mm, 4 pack – for attaching laser to sterotax
Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter	Fine Science Tools	19007-05	For creating burr hole
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate	VWR	EM1.01036.0250
Compact Controller for pigtailed lasers	Thorlabs	CLD1010LP
Cotton Swabs	VWR	89031-288
CP 25 pipette tips	Gilson	F148012
Donkey anti-goat IgG H&L (488)	abcam	ab150129
Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647)	abcam	ab150075
Donkey Anti-rat IgG H&L (555)	abcam	ab150154
EMS DPX Mountant	Elecron Microscopy Sciences	13512	Mounting solution for slides
EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom	Electron Microscopy Sciences	16564	For gelatin coating slides
EMS Paraformaldehyde, Granular	VWR	100504-162	For making 45 PFA
ESD Worstation kit	Elmstat	WSKK5324SB	Need for setting up the laser
Fiber Bench Wall Plate, unthreaded	Thorlabs	HCA3	Need for connecting laser to Kopf shaft
FiberPort	Thorlabs	PAF-X-5-A	FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm
Fine Scissors – straight/sharp-blunt/10cm	Fine Science Tools	14028-10
GFAP Antibody, rat	Thermo Fisher Scientific	13-0300
Heating Plate	Kopf Instruments	HP-4M
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	H-4000	For staining slides
IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center	VetEquip	901808
Iodine Prep Pads	Medx Supple	MED MDS093917H
Jewlers Forceps #5	GFS chemicals	46085
Laser Safety Glasses	Thorlabs	LG10B	Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too)
M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck	United Scope	LED-11C
Medical USP Grade Oxygen	Airgas	OX USP250
Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade	Intefra Miltex	V96-118
Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer	Harvard aparatus	72-6110
Mini-pump variable flow	Thomas Scientific	70730-064	Pump for perfusions
Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm	Kent Scientific	RBMA-200c	For TTC slices
Mouse Gas Anethesia Head Holder	Kopf Instruments	923-B
Nanojet Control Box	Chemyx	10050
Nanojet pump header	Chemxy	10051	Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial
Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch	Fishcer Scientific	NC9459562
Non-rupture ear bars 60º	Kopf Instruments	922
PBS buffer pH 7.4	VWR	97062 338
Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin	Thorlabs	LP520-MF100
Positive charge glass slides	Hareta	AHS90-WH
Power engergy meter	Thorlabs	PM100D	Used to measure your mW laser output
Puralube Vet Ointment	Dr. Foster Smith	9N-76855
Rectal Probe Mouse	kopf Instruments	Ret-3-ISO
Rose Bengal Dye 95%	Sigma-Aldrich	330000-5G
Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth	Kopf Instruments	1770-02	For connecting laser to sterotaxic device
Slim photodiode power sensor	Thorlabs	S130VC	Used with power energy meter
SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining	Thorlabs	CP02	For connecting laser expander
Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL	VWR	10002-726	To inject rose bengal
StainTray Slide Staining System	Simport Scientific	M920-2	For staining slides
Sterotaxic device	Kopf Instruments	940	Small Animal Stereotaxic Instrument
Student Adson Forceps -1×2 teeth	Fine Science Tools	91127-12
Student Fine Forceps – straight/broad Shanks	Fine Science Tools	91113-10
Temperature Controller	Kopf Instruments	TCAT-2LV
Tissue-Tek OCT compound	VWR	25608-930
Triton X-100	VWR	97063-864
Upper Bracket Clamp	Kopf Instruments	1770-c	For connecting laser to sterotaxic device
Vetbond Tissue Adhessive 3mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-361931
Vogue Professional My Manicurist	Bargin Source	6400	For Burrs
VWR Bead Sterilizers	VWR	75999-328
Tissue Tek OCT compound	Sakura	4583	For tissue embeding