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Biology

रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद माउस में मूत्राशय के आणविक विश्लेषण के लिए एक एकल सेल विघटन दृष्टिकोण

Published: June 17, 2020 doi: 10.3791/61455
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1, 3,4,5, 1,6, 1,2, 2,7, 2,7, 1,2
1Department of Urology, Boston Children's Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Division of Hematology/Oncology, Harvard Medical School Boston, 4Dana-Farber Cancer Institute, 5Broad Institute, 6Biological Biomedical Sciences Program, Division of Medical Sciences, Harvard Medical School, 7Vascular Biology Program, Boston Children's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य रीढ़ की हड्डी की चोट के माउस मॉडल के लिए एक अनुकूलित ऊतक वियोजन प्रोटोकॉल लागू करना और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एकल कोशिका विश्लेषण के लिए दृष्टिकोण को मान्य करना है।

Abstract

हम चूहों में रीढ़ की हड्डी की चोट के कार्यान्वयन का वर्णन करने के लिए detrusor-स्फिंकर डिस्सिनर्जिया, एक कार्यात्मक मूत्राशय आउटलेट बाधा, और बाद में मूत्राशय की दीवार remodeling प्रकाश में लाना । गैर-घायल नियंत्रण और रीढ़ की हड्डी से घायल चूहों में मूत्राशय की दीवार की सेलुलर संरचना के मूल्यांकन को सुविधाजनक बनाने के लिए, हमने एक अनुकूलित वियोजन प्रोटोकॉल विकसित किया जो उच्च कोशिका व्यवहार्यता का समर्थन करता है और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा असतत उप-आबादी का पता लगाने में सक्षम बनाता है।

रीढ़ की हड्डी की चोट छाती रीढ़ की हड्डी के पूर्ण ट्रांसेक्शन से बनती है। ऊतक फसल के समय, जानवर को गहरे संज्ञाहरण के तहत फॉस्फेट-बफर नमकीन के साथ छिद्रित किया जाता है और मूत्राशय को टायरोड के बफर में काटा जाता है। ऊतकों को पाचन बफर में इनक्यूबेशन से पहले कीमा बनाया गया है जिसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध जीन अभिव्यक्ति डेटाबेस से पूछताछ के अनुसार माउस मूत्राशय की कोलेजन सामग्री के आधार पर अनुकूलित किया गया है। एकल कोशिका निलंबन के बाद, कोशिका व्यवहार्यता, कोशिका संख्या और विशिष्ट उप-जनसंख्या के मूल्यांकन के लिए प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सामग्री का विश्लेषण किया जाता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि विधि 90% से अधिक व्यवहार्यता के साथ सेल आबादी की पैदावार करती है, और मेसेंचिमल और एपिथेलियल मूल की कोशिकाओं का मजबूत प्रतिनिधित्व करती है। यह विधि माउस मूत्राशय और संभावित अन्य अंगों में असतत कोशिका प्रकारों के सटीक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को सक्षम करेगी।

Introduction

सामान्य मूत्राशय समारोह के क्षोभ कई व्यक्तियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में कमी का कारण बन सकता है। कैसे चोट या रोग सामान्य मूत्राशय समारोह पटरी से उतर की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए, यह मूत्राशय के भीतर कोशिकाओं की सामान्य जैविक स्थिति की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है और कैसे वे प्रयोगात्मक क्षोभ के तहत बदल जाते हैं । आज तक, हालांकि, मूत्राशय के भीतर रहने वाली विशिष्ट सेल आबादी, और वे चोट के साथ कैसे बदलते हैं, पूरी तरह से विशेषता है।

एकल सेल प्रोफाइलिंग विधियों जैसे फ्लो साइटोमेट्री या सिंगल सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (स्क्रएनए-एसईक्यू) में मूत्राशय के भीतर विशिष्ट कोशिका प्रकारों पर प्रकाश डालने की क्षमता होती है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों के लिए जानकारीपूर्ण ऊतक होने के लिए एक तरह से पचाया जाना चाहिए जो व्यवहार्यता, जीन अभिव्यक्ति और काटे गए ऊतकों के प्रतिनिधि सेल जनसंख्या प्रतिशत को प्रभावित नहीं करता है। एंजाइमेटिक डिसगिगेशन को नियोजित करने वाले प्रोटोकॉल अंधाधुंध प्रोटीज गतिविधि1के माध्यम से सतह मार्कर अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सेल पहचान प्रभावित हो सकती है, जबकि वियोजन प्रक्रिया से ही तत्काल प्रारंभिक जीन को शामिल किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही में वान डेन ब्रिंक और सहकर्मियों द्वारा वर्णित है2। लेखकों से पता चला है कि हालांकि वियोजन प्रभावित उपआबादी छोटी थी, यह तत्काल प्रारंभिक जीन के उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के कारण थोक अभिव्यक्ति अध्ययन में एक मजबूत दूषित संकेत ट्रिगर सकता है । इसके अलावा, वियोजन प्रोटोकॉल प्रभावित की अवधि जीन के थोक अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाया कुछ उपआबादी के लिए अद्वितीय होना दिखाया । इस प्रकार, वियोजन प्रोटोकॉल के प्रभाव के लिए लेखांकन के बिना उत्पन्न एकल सेल डेटासेट अंतर्निहित जीव विज्ञान के विपरीत, वियोजन विधि से उत्पन्न जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन प्राप्त कर सकते हैं। इन टिप्पणियों से पता चलता है कि प्रकाशित एकल सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा की सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए, और परिणामों को स्वतंत्र तरीकों से मान्य किया जाना चाहिए ।

हालांकि, कठोर और लंबी वियोजन विधियां कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति को बदल सकती हैं2; कोशिकाओं का प्रभावी अलगाव मौजूद कोशिका प्रकारों का सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। चूंकि मूत्राशय एक जटिल अंग है जिसमें कई सेल प्रकार शामिल हैं, इसलिए कुछ आबादी जैसे यूरोथेलियल या स्ट्रोमल कोशिकाओं को अपेक्षाकृत कम प्रतिनिधित्व किया जा सकता है जबकि फाइब्रोब्लास्ट जैसे अन्य सेल प्रकार एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के भीतर मौजूद हैं और अलग-थलग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। यदि मूत्राशय में महत्वपूर्ण रिमॉडलिंग और फाइब्रोसिस हो गया है , जैसे रीढ़ की हड्डी की चोट 3 ,4या मूत्राशय के आउटलेट बाधा5 , 6 में देखा गया हैतोविच्छेदन और भी चुनौतीपूर्ण होजाताहै ।

यहां, हम रीढ़ की हड्डी से घायल माउस मूत्राशय में डाउनस्ट्रीम सिंगल सेल विश्लेषण के लिए एक अनुकूलित ऊतक वियोजन विधि का वर्णन करते हैं। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके, हमने एकल कोशिका निलंबन, समर्थन सेल व्यवहार्यता और कोशिका आबादी के सही अनुपात को बनाए रखने की क्षमता के लिए चार एंजाइमेटिक पाचन प्रोटोकॉल की तुलना की। इस विश्लेषण के आधार पर, हम निष्कर्ष निकालते हैं कि उच्च गुणवत्ता वाले डेटा को प्राप्त करने के लिए सेल मृत्यु, सेलुलर समुच्चय, गैर-सेलुलर न्यूक्लिक एसिड और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के संभावित अवरोधकों को कम करना महत्वपूर्ण है।

Protocol

प्रक्रियाओं की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार सख्त प्रदर्शन किया गया । सभी प्रयोगों को बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल की एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

नोट: चूहों को भोजन और पानी के लिए विज्ञापन लिबिटम पहुंच के साथ AAALAC-मान्यता प्राप्त पशु सुविधा में रखे गए थे । इन प्रयोगों के लिए 8\u201212 सप्ताह की उम्र में मादा चूहों का उपयोग किया गया था। चोट की प्रकृति को देखते हुए, चूहों को उनकी भलाई सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त पोषण संवर्धन प्रदान किया गया था।

1. चूहों में कम वक्ष रीढ़ की हड्डी का ट्रांसेक्शन

  1. रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन से पहले तैयारी
    नोट: इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों माइक्रो विच्छेदन वसंत कैंची, माइक्रो विच्छेदन संदंश, माइक्रो टांका सुई चालक, हेमोस्टैट्स, और 7-0 पॉलीग्लेक्टिन ९१० टांके हैं । आवश्यक अन्य सर्जिकल आपूर्ति सर्जिकल पर्दे, सर्जिकल क्षेत्र के लिए बाँझ चादरें, धुंध स्पंज, कपास टिप एप्लिकेटर, और 25 जी सुइयों के साथ 1 एमएल सीरिंज हैं।
    1. सर्जरी से पहले सर्जिकल उपकरणों और आपूर्ति को ऑटोक्लेव करें।
    2. सर्जिकल क्षेत्र और हीटिंग पैड को अल्कोहल वाइप्स से साफ करें। एक हीटिंग पैड सर्जरी के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा और दूसरे तत्काल पश्चात अवधि के लिए पूरी गतिविधि फिर से हासिल करने तक जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए ।
    3. सर्जिकल प्रक्रिया को करने के लिए आवर्धक loupes (2.5x या अधिक) का उपयोग करें।
    4. प्रक्रिया के दौरान उपयोग के लिए तैयार होने के लिए हीटिंग पैड, प्रकाश स्रोत और ग्लास मनका स्टरलाइजर पर स्विच करें।
    5. सर्जिकल पर्दे और उपकरणों को खोलें। सर्जिकल क्षेत्र को ड्रेप करने और उपकरणों को सर्जिकल क्षेत्र में रखने के लिए बाँझ दस्ताने का उपयोग करें।
  2. जानवरों की तैयारी
    1. प्रक्रिया कक्ष में चूहों को लाएं और रीढ़ की हड्डी से घायल चूहों के लिए एक साफ पिंजरे भी लाएं।
    2. आइसोफ्लोरैन प्रवाह के साथ इंडक्शन चैंबर में माउस रखकर संज्ञाहरण का प्रशासन करें, 3.0% पर सेट करें, 1 एल/मिनट पर ऑक्सीजन प्रवाह, और 20 एमएमएचजी पर सक्शन जब तक कोई पंजा-चुटकी प्रतिक्रिया नहीं है।
    3. तुरंत जानवर का वजन करें और फिर जानवर को हीटिंग पैड पर प्रवण स्थिति में रखें।
    4. माउस की नाक पर एनेस्थेटिक शंकु को संक्षेप में रखें, गैस प्रवाह को इंडक्शन चैंबर से नाक शंकु में स्विच करें, और आइसोफ्लोरेन प्रवाह को 2% और ऑक्सीजन प्रवाह को 1 एल/मिनट में सेट करें।
    5. पुष्टि करें कि पंजा-चुटकी के जवाब के अभाव में जानवर पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड है। हीटिंग पैड के लिए पशु अंगों टेप। निचले वक्ष कशेरुकी को खोलने के लिए निचले छाती के नीचे धुंध स्पंज का एक लुढ़का हुआ टुकड़ा रखें और फ्लेक्स करें।
    6. दोनों आंखों पर नेत्र स्नेहक लगाएं। दर्द की दवा (Meloxicam, 10 मिलीग्राम/किलो, चमड़े के नीचे) और एंटीबायोटिक (Enrofloxacin, 5 मिलीग्राम/किलो, चमड़े के साथ) ।
      नोट: अंत उपयोगकर्ताओं को दर्द की दवा और उनके स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुशंसित एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करना चाहिए ।
    7. छाती की रीढ़ की हड्डी में सबसे प्रमुख स्पाइनस प्रक्रिया को पलटें जो आमतौर पर टी 13 स्पिनस प्रक्रिया7से मेल खाती है। सबसे प्रमुख स्पिनस प्रक्रिया (T13) के ठीक नीचे और मिडलाइन के प्रत्येक पक्ष पर 1 सेमी के लिए माउस के पीछे एक देशांतर आयत क्षेत्र दाढ़ी।
  3. सर्जिकल प्रक्रिया
    1. 10% povidone आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल के साथ मुंडा क्षेत्र को तीन बार वैकल्पिक रूप से चीरा साइट से शुरू होने वाले एक परिपत्र फैशन में बाहर काम कर रहा है और फिर शल्य चिकित्सा क्षेत्र में एक खिड़की के साथ बाँझ 4 x 4 धुंध स्पंज के साथ जानवर को कवर करें।
    2. सबसे प्रमुख स्पिनस प्रक्रिया (T13) पर समाप्त होता है कि ठीक कैंची का उपयोग कर पीठ के मध्य रेखा में 1.5 सेमी चीरा बनाओ। चीरा त्वचा और सतही प्रावरणी शामिल होना चाहिए। कैंची का उपयोग करने से त्वचा और सतही प्रावरणी दोनों तरफ पतली प्रक्रियाओं और आसपास के परजीवी मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए अलग करें।
    3. तेज और कुंद विच्छेदन का उपयोग करने से मांसपेशियों को स्पिनस प्रक्रियाओं और टी 9, टी10 और टी11 कशेरुकी के लैमिने से अलग किया जाता है।
    4. टी 9 और टी 10 के बीच और टी10 और टी11 के बीच इंटरस्पिनस लिगामेंट्स को बारीक कैंची का उपयोग करके तेजी से विभाजित करें और फिर टी 10 की स्पिनस प्रक्रिया को उत्पादित करें और रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए द्विपक्षीय रूप से T10 टुकड़ेिनेक्टॉमी का प्रदर्शन करें। सुनिश्चित करें कि लैमिना पूरी तरह से उत्पादित हैं।
    5. ठीक कैंची का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी को पार करें। रीढ़ की हड्डी के जहाजों के ट्रांसेक्शन के कारण आमतौर पर इस बिंदु पर न्यूनतम रक्तस्राव होता है। हेमोसिस को प्राप्त करने के लिए एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator के साथ रक्तस्राव क्षेत्र को सेक करें। पूर्ण हेमोसेसिस की पुष्टि करने के बाद, त्वचा को 7-0 पॉलीग्लेक्टिन 910 निरंतर टांके के साथ बंद करें।
    6. पोस्टऑपरेटिव डिहाइड्रेशन को रोकने के लिए नमकीन समाधान के 1 एमएल को कम से कम प्रशासित करें।
  4. पश्चात देखभाल
    1. पूरी वसूली होने तक एक हीटिंग पैड पर जानवर रखें, फिर केवल रीढ़ की हड्डी घायल-चूहों के लिए एक पिंजरे में स्थानांतरित करें।
    2. पश्चात देखभाल में जानवरों को दैनिक रूप से देखना और तौलना, और 7 दिनों तक संक्रमण के संकेतों के लिए चीरा साइट की निगरानी शामिल है। 1 मिलीएल खारा समाधान, एनाल्जेसिक (मेलोक्सिकम 10 मिलीग्राम/किलो), और एंटीबायोटिक (enrofloxacin 5 मिलीग्राम/kg) सभी 3 दिनों के लिए दैनिक चमड़े के रूप में प्रशासन ।
      नोट: अंत उपयोगकर्ताओं को दर्द की दवा और उनके स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुशंसित एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करना चाहिए ।
    3. हर 12 घंटे में मैनुअल मूत्राशय अभिव्यक्ति (क्रेडे पैंतरेबाज़ी) करें जब तक कि जानवर अपने आप (आमतौर पर 10 से 14 दिनों में) पेशाब करने में सक्षम न हो जाए। एक हाथ से जानवर को पकड़ें और दूसरे हाथ से निचले पेट की मालिश करें, फिर महसूस करें और धीरे-धीरे इंडेक्स फिंगर और अंगूठे के साथ डिटेन्ड मूत्राशय को सेक करें। कोमल क्षणिक संपीड़न विश्राम के साथ वैकल्पिक होना चाहिए। मैनुअल अभिव्यक्ति के बाद, निचले पेट को नल के पानी से धोएं और अत्यधिक रगड़ के बिना कागज के तौलिया से धीरे-धीरे सूखें।
      नोट: अभिव्यक्ति की शुरुआत और मूत्र के साथ निचले पेट के गीला होने से पहले मूत्राशय का एक छोटा आकार इस बात के संकेत हैं कि जानवर ने अपने दम पर शून्य करने की क्षमता प्राप्त की है।
    4. वजन घटाने को कम करने के लिए, पोषक जेल और अन्य पौष्टिक व्यवहार (बेकन सॉफ्टीज, फल कुरकुरे और वेजी काटने) के रूप में चूहों को पोषण संवर्धन प्रदान करना आसान पहुंच नोट के लिए पिंजरे के फर्श पर रखा गया: इस अध्ययन में, चूहों को सीआईके बाद 8 सप्ताह में खरीदा गया था और मूत्राशय खरीदे गए थे।
  5. पश्चात जटिलताएं
    1. मूत्राशय को पूरी तरह से व्यक्त न करके अति उत्साही मैनुअल मूत्राशय अभिव्यक्ति के कारण मूत्राशय के टूटने की क्षमता को कम करें।
    2. पेरिनल त्वचा के उपचार को नल के पानी के साथ पेरिनेल क्षेत्र की धुलाई के माध्यम से अक्षम स्फिंकर से मूत्र चूना के निरंतर संपर्क से रोकें। ट्रिपल एंटीबायोटिक मरहम के आवेदन के माध्यम से सूजन को कम करें।
      नोट: क्षणिक हेमेटुरिया की अवधि के दौरान रक्त के थक्के के कारण या पुरुष चूहों में प्रतिगामी स्खलन के कारण वीर्य कोगुलम से मूत्रमार्ग बाधा रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद हो सकती है। पुरुष चूहों में पूर्ण मूत्रमार्ग बाधा अक्सर मूत्राशय टूटना और मृत्यु में खत्म होती है। हमारे अनुभव में पुरुष चूहों में मूत्रमार्ग बाधा की आवृत्ति जो मौत का कारण बनी, 10% थी।

2. परफ्यूजन और ऊतक खरीद

नोट: परिधीय ऊतकों में प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे कुछ सेल प्रकारों के डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए ऊतक फसल के समय परफ्यूजन द्वारा रक्त को हटाना फायदेमंद होता है, जैसा कि नीचे वर्णित है।

  1. जैसा कि शल्य चिकित्सा प्रक्रिया (चरण 2.2) में उल्लेख किया गया है संज्ञाहरण को प्रशासित करें और पुष्टि करें कि जानवर पर्याप्त रूप से कोई पूर्वा-चुटकी प्रतिक्रिया के साथ एनेस्थेटाइज्ड है (जानवर पैराप्लेजिक है, इसलिए हिंडलिम्ब्स सनसनी कम हो गए हैं और हिंडपॉ-चुटकी प्रतिक्रिया अप्रासंगिक हो जाती है)।
  2. जानवर को रीढ़ की स्थिति में रखें और पेट और छाती को 70% इथेनॉल के साथ झाड़ू लगाते हैं ताकि फर को ऑपरेटिंग साइट में आने से रोका जा सके।
  3. श्रोणि से डायाफ्राम तक मिडलाइन लेप्रोटॉमी करें। डायाफ्राम को पसलियों से दूर काट लें।
    नोट: इस कदम के बाद, गति महत्वपूर्ण है क्योंकि छाती दबाव अंतर अब मौजूद नहीं है और फेफड़े बढ़ नहीं सकते हैं, इसलिए जानवर घुटन शुरू हो जाता है।
  4. छाती को बाईं और दाईं ओर पसलियों के साथ खुला काटें बोन-कार्टिलेज सीमा के बाद एक लाइन पर उरोस्थि के समानांतर, डायाफ्राम से शुरू होता है और जहां तक पहली पसली के रूप में आगे बढ़ना होता है।
  5. जानवर के सिर पर पूर्ण पूर्वकाल छाती की दीवार रखें और तौलिया क्लैंप का उपयोग करके इसे इस स्थिति में ठीक करें। पूर्वकाल छाती की दीवार को न काटें क्योंकि इससे दो आंतरिक वक्ष धमनियों से गंभीर रक्तस्राव होगा।
  6. ठीक कैंची का उपयोग कर पेरिकार्डियम को काट लें।
  7. परफ्यूजन उपकरण के लिए एक 23 जी सुई कनेक्ट, तो यह बाएं वेंट्रिकल में डालें और धीरे-धीरे महाधमनी में, यह पंचर नहीं करने के लिए ध्यान रखते हुए।
    नोट: परफ्यूजन उपकरण में एक परफ्यूजन पंप और नसों में टयूबिंग से जुड़े 50 एमएल सिरिंज शामिल हैं।
  8. परफ्यूजन शुरू करें और जल निकासी के लिए सही एट्रियम में ठीक कैंची की नोक के साथ जल्दी से एक छोटा सा कट बनाएं। तरल पदार्थ जलसेक के दौरान हवा के बुलबुले पेश न करने का ध्यान रखें।
  9. 15 एमएल/मिनट पर चलने वाले फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) समाधान के साथ परफ्यूजन करें । जल निकासी स्पष्ट होने पर पर्फ्यूजन पूरा हो जाता है और जिगर का हल्का रंग प्राप्त होता है(चित्र 1)।
    नोट: पर्फ्यूजन के लिए औसत समय 3.5-4 मिनट था। अपर्याप्त परफ्यूजन ऊतकों के ब्लैंचिंग की धीमी प्रगति के रूप में प्रकट होता है और आमतौर पर बाएं वेंट्रिकल में सुई की गलत स्थिति के कारण होता है। सुई को समायोजित करना और 1 से 2 मिनट के लिए पर्फ्यूजन की अवधि बढ़ाना ऊतकों के पर्याप्त पर्फ्यूजन सुनिश्चित करेगा।
  10. परफ्यूजन को बंद करें और मूत्राशय को संवहनी पेडिकल्स और मूत्रमार्ग से मुक्त करें और इसे बर्फ-ठंडे टायरोड के समाधान वाले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें।

3. नियंत्रण और रीढ़ की हड्डी से घायल चूहों में मूत्राशय का पाचन

नोट: एक कुशल पाचन मिश्रण तैयार करने के लिए जो माउस मूत्राशय के अनुरूप है, हमने कोलेजन और हायलूरोनिक एसिड जैसे प्रमुख बाह्य मैट्रिक्स घटकों को नीचा दिखाने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों की इकाई को समायोजित करने की मांग की। इसलिए, हमने मूत्राशय के भीतर स्थानिक अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए प्रति किलोबेस प्रति मिलियन (आरपीकेएम) और तबला मुरिस8 को निकालने के लिए माउस एनकोड परियोजना (बायोप्रोजेक्ट: PRJNA66167) द्वारा उत्पन्न सार्वजनिक रूप से उपलब्ध आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग किया। कोलेजन 1, 3 और 6 42 विभिन्न कोलेजन(चित्रा 2 ए)के बीच तीन सबसे उच्च व्यक्त जीन थे। उन कोलेजन और हायलुरोनन सिंथेस 1 (Has1) की अभिव्यक्ति ज्यादातर मांसपेशियों की कोशिकाओं और मूत्राशय की दीवार(चित्रा 2B)के फाइब्रोब्लास्ट में देखी गई थी।

  1. बफ़र्स और समाधान की तैयारी
    1. साफ 500 एमएल की बोतल में टेबल 1 के अनुसार सोडियम टायरोड घोल तैयार करें। डीडीएच2ओ का 300 एमएल जोड़ें। तैयारी के बाद समाधान अम्लीय है। नाओएच का उपयोग करके पीएच को 7.4 तक समायोजित करें। डबल डिस्टिल्ड एच2ओ का उपयोग करके 500 एमएल तक वॉल्यूम लाएं, फिर एलिकोट और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह बफर पाचन बफर में पीएच और ऑस्मोटिक संतुलन बनाए रखता है और कोशिकाओं को पानी और आवश्यक अकार्बनिक आयनों के साथ प्रदान करता है। इसमें मैग्नीशियम होता है, साथ ही ग्लूकोज भी ऊर्जा स्रोत के रूप में होता है। समाधान में पोटेशियम अलग सेल समाधान में विद्युत गतिविधि पर सुरक्षात्मक प्रभाव प्रदान करता है। पाउडर साल्ट हाइग्रोस्कोपिक होते हैं और नमी से सुरक्षित रहना चाहिए। मिश्रण की पूरी सामग्री तैयार करने के तुरंत बाद उपयोग की जानी चाहिए। एक केंद्रित नमक समाधान तैयार करने की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि वर्षा बन सकती है। यदि कोशिकाओं को विश्लेषण के बाद सुसंस्कृत किया जा रहा है तो निस्पंदन (0.22 माइक्रोन फिल्टर) का उपयोग करके नसबंदी की जा सकती है।
    2. प्रत्येक घटक(तालिका 2)के लिए अनुशंसित मात्रा और मात्रा जोड़कर 15 एमएल शंकु नली में एंजाइमेटिक पाचन समाधान तैयार करें। 2.5 एमएल तक सोडियम टायरोड समाधान जोड़ें। भंवर को अच्छी तरह से भंग करने के लिए।
      नोट: पपिन कैरिका पपीता लेटेक्स से एक सल्फ्रीड्रिल प्रोटीज है। पापिन में व्यापक विशिष्टता है और यह अधिकांश प्रोटीन सब्सट्रेट्स 9 को नीचा दिखादेगा। पापिन सेल वियोजन प्रोटोकॉल10में अन्य प्रोटीज की तुलना में कम हानिकारक और अधिक प्रभावी साबित हुआ है । हम तालिका 2में चार वियोजन प्रोटोकॉल के बारे में विवरण प्रदान करते हैं; हमने उच्चतम व्यवहार्यता (93%) का समर्थन करने के लिए प्रोटोकॉल धारा 3 का अवलोकन किया माउस मूत्राशय से तैयार सेल निलंबन की।
  2. विच्छेदन प्रक्रिया और सेल निलंबन की तैयारी
    1. चूहों के बाद परफ्यूजन से मूत्राशय ले लीजिए।
    2. सामग्री जारी करने के लिए मूत्राशय पंचर, यदि कोई हो।
    3. एक खाली 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और धड़ा के लिए टायरोड के समाधान के 100 μL जोड़ें। मूत्राशय को ट्यूब में रखें और एक सटीक मूत्राशय वजन निर्धारित करने के लिए फिर से वजन करें।
    4. मूत्राशय को बर्फ पर 10 सेमी पेट्री डिश पर रखें और कीमा बनाने के लिए 100 माइक्रोन का टाइरोड के घोल डालें।
    5. सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, जितना संभव हो उतना छोटा टुकड़े काटते हुए, मूत्राशय प्रति 2\u20123 मिनट से अधिक समय को कम नहीं करता है। यदि कई जानवरों से मूत्राशय के ऊतकों को पूल करते हैं, तो मूत्राशय को एक बार में कीमा बना लें।
    6. प्रत्येक मूत्राशय के लिए पाचन बफर के 2.5 एमएल में एक विस्तृत बोर पाइप टिप का उपयोग करके कीमा बनाया हुआ मूत्राशय ऊतक स्थानांतरित करें। यदि कई मूत्राशय जमा किए गए हैं तो वॉल्यूम को समायोजित करें। पाचन समाधान में ऊतक को 40 मिनट के लिए एक न्यूलेटर मिक्सर पर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, इनक्यूबेटर से पाचन नली को हटा दें। ट्राइटरेट (ऊपर और नीचे पाइप) पाचन समाधान 1 मिनट के लिए 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट निकालें और सेल टुकड़ी समाधान के 1 एमएल में गोली को फिर से रीसस्ट करें। 10 मिनट के लिए न्यूलेटर मिक्सर पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनेट निकालें और आरबीसी लाइसिस बफर (1x) के 1 एमसीएल में गोली को फिर से रीसस्ट करें। 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    10. आरबीसी बफर को पतला करने और आरबीसी लाइसिस को रोकने के लिए 9 एमएल पीबीएस जोड़ें।
    11. 50 μm सेल छलनी के माध्यम से 50 μm सेल छलनी के माध्यम से कोशिकाओं को 50 एमएल शंकु नली में पास करें, एक सिरिंज से प्लंजर का उपयोग करने के लिए हल्के से पूर्ण सेल मार्ग सुनिश्चित करने के लिए सेल छलनी परिमार्जन। तरल है कि छलनी के माध्यम से गुजरता है, लेकिन छलनी के नीचे पर पकड़ा जा सकता है इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 350 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। सुपरनैंट निकालें और सेल स्टेनिंग बफर (2% एफबीएस के साथ पीबीएस) के 200 माइक्रोन में गोली को फिर से खर्च करें।
    13. कोशिकाओं की गिनती करें।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए विशिष्ट कोशिकाओं की इम्यूनोबेलिंग
    नोट: मूत्राशय में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, हमने एक बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पैनल तैयार किया। मुआवजा प्रदर्शन करने और एक उपयुक्त गेटिंग रणनीति ईजाद करने के लिए, हम अन दागदार और फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण शामिल हैं। एफएमओ नियंत्रण सकारात्मक आबादी को गेट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, खासकर जब सकारात्मक अंश मंद होता है। धुंधला प्रक्रिया इस प्रकार है।
    1. कोशिकाओं पर FcγRII/III रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करना
      नोट: हम मोनोक्लोनल एंटी-एफसी रिसेप्टर एंटीबॉडी, या रीकॉम्बिनेंट एफसी प्रोटीन के साथ कोशिकाओं के पूर्व-इनक्यूबेशन द्वारा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को अवरुद्ध करने की सलाह देते हैं।
      1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को धोएं और सेल धुंधला बफर जोड़ें।
      2. 1:100 के कमजोर पड़ने पर सेल धुंधला बफर में CD16 और CD32 एंटीबॉडी जोड़कर गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला को रोकने के लिए कोशिकाओं पर सुपरनेट और ब्लॉक FcγRII/III रिसेप्टर्स को छोड़ दें ।
      3. 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
        नोट: कोशिकाओं को धोने की कोई आवश्यकता नहीं है; कोशिकाओं को इस चरण के बाद सीधे दाग दिया जा सकता है।
    2. एफएमओ के लिए धुंधला
      नोट: फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी फ्लोरोक्रोम की एक ट्यूब है जिसमें एक को छोड़कर सभी फ्लोरोक्रोम शामिल हैं।
      1. उदाहरण के लिए, यदि किसी के पास 4 अलग-अलग फ्लोरोक्रोम (ए, बी सी और डी + एनेक्सटिन वी और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) हैं, तो एफएमओ ट्यूब को निम्नलिखित के रूप में तैयार करें। एफएमओ ट्यूब 1: एंटीबॉडी बी, सी, डी फ्लोरोक्रोम + (एनेक्सटिन वी और पीआई) के साथ संयुग्मित; एफएमओ ट्यूब 2: ए, सी, डी फ्लोरोक्रोम + (एनेक्सटिन वी और पीआई) के साथ एंटीबॉडी को संयोजित किया गया; एफएमओ ट्यूब 3: ए, बी, सी फ्लोरोक्रोम + (एनेक्सटिन वी और पीआई) के साथ एंटीबॉडी को संयोजित किया गया; एफएमओ ट्यूब 4: ए, बी, सी, डी फ्लोरोक्रोम + (एनेक्सटिन वी) के साथ एंटीबॉडी कंजूसी की गई; एफएमओ ट्यूब 5: एंटीबॉडी ए, बी, सी, डी फ्लोरोक्रोम + (पीआई) के साथ संयुग्मित।
      2. एनेक्सटिन वी एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित फ्लोरोक्रोम की प्रकृति पर विचार करें।
    3. वांछित एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध कोशिकाओं को धुंधला करना
      1. प्रकाश से संरक्षित बर्फ पर 20 मिनट के लिए वांछित प्रोटीन के खिलाफ फ्लोरोफोर-कंजूग्ड एंटीबॉडी के उपयुक्त मास्टर घोला जा सकता है के साथ इनक्यूबेट अवरुद्ध कोशिकाओं । एफएमओ को शामिल करना याद रखें।
      2. सेल धुंधला बफर के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धोने प्रत्येक ट्यूब में जोड़ा और फिर 10 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ३५० x g पर फिर से अपकेंद्रित्र ।
      3. सुपरनेट को त्यागें और सेल धुंधला बफर के 200 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। बर्फ पर तब तक रखें जब तक फ्लोरेसेंस डेटा एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।
    4. एनेक्सटिन वी/पीआई दाग लगाएं ।
      1. मृत सेल एपोप्टोसिस किट के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित 1x एनेक्सलिन-बाइंडिंग बफर में पीआई (100 माइक्रोग्राम/एमएल) का एक कार्य समाधान तैयार करें।
      2. सेल घनत्व निर्धारित करें और बफर और वॉल्यूम पर ध्यान दें जिसमें वे संग्रहीत हैं।
      3. 5 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूने, 1x एनेक्सिन-बाइंडिंग बफर में सुपरनेट और रिसिपेंड कोशिकाओं को ~ 1 x 106 कोशिकाओं/100 माइक्रोन की मात्रा में एमएल के घनत्व में त्यागें।
      4. निर्माता के प्रोटोकॉल में वर्णित प्रत्येक नमूने (100 माइक्रोन) में फिटसी-एनेक्सटिन वी (5 माइक्रोन) और पीआई वर्किंग सॉल्यूशन (1 माइक्रोन) जोड़ें, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      5. नमूनों में 1x एनेक्सटिन-बाइंडिंग बफर के 400 माइक्रोन जोड़ें, उलटा करके मिलाएं और प्रवाह साइटोमेट्री तक बर्फ पर रखें।
  4. FACS अंशांकन
    1. फ्लो साइटोमेट्री और शुद्धता नियंत्रण
      1. कोशिका आकृति विज्ञान और फ्लोरोक्रोम के गर्त को चित्रित करने के लिए अन दाग कोशिकाओं को मापने के द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण शुरू करें।
      2. प्रत्येक फ्लोरेसेंस पैरामीटर के वोल्टेज को संशोधित करके साइड स्कैटर (एसएससी) और फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) को समायोजित करें। 530 एनएम (एनेक्सटिन वी) और >575 एनएम (पीआई) पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन को मापें।
      3. प्रत्येक डॉट प्लॉट पर ग्रिड का उपयोग करके पहले दशक में नकारात्मक आबादी को परिभाषित करें। प्रत्येक एफएमओ नियंत्रण को साइटोमीटर में रखें और स्पेक्ट्रल ओवरलैप को सही करें जब तक कि नकारात्मक और सकारात्मक जनसंख्या औसत गठबंधन न हो जाए।
      4. 100,000 घटनाओं को मापें। विशिष्ट मार्कर के साथ दाग कोशिकाओं को मापने और ब्याज की सेल आबादी के लिए द्वार बनाने के लिए।
  5. डेटा विश्लेषण
    1. फ्लो साइटोमीटर से डेटा एकत्र करें। विश्लेषण के लिए कार्यक्षेत्र की कल्पना करने के लिए सॉफ्टवेयर खोलें।
    2. एक कार्यक्षेत्र बनाना
      1. एफसीएस फाइलों को कार्यक्षेत्र में खींचकर आयात करें। कार्यक्षेत्र के सैंपल और ग्रुप सेक्शन में फाइलें दिखाई देंगी। फाइल खोलने के लिए सैंपल नाम से डबल क्लिक करें।
      2. एक्स-एक्सिस(चित्रा 3 ए)के लिए वाई-एक्सिस और फॉरवर्ड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) के लिए साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) का इस्तेमाल करें । पॉलीगॉन गेटिंग के लिए आइकन पर क्लिक करें।
      3. एक गेट नोड बनाने के लिए क्लिक करके डॉट प्लॉट में ब्याज की सेल आबादी के चारों ओर एक गेट बनाएं और फिर पूरा होने तक सेल आबादी के चारों ओर क्लिक करना जारी रखें; गेट बंद करने के लिए डबल क्लिक करें।
      4. कब्जा कर लिया आबादी के अनुसार गेट का नाम (उदाहरण के लिए, "सभी कोशिकाओं") और ठीकक्लिक करें ।
        नोट: "सभी कोशिकाओं" गेट के भीतर डबल क्लिक करने से एक नया ग्राफ विंडो खुलेगा जिसमें केवल "सभी कोशिकाओं" में निहित घटनाएं दिखाई देंगी।
      5. नए डॉट प्लॉट की वाई-एक्सिस को काले तीर में क्लिक करके एसएससी-एच (साइड स्कैटर हाइट) में एडजस्ट करें और वाई-एक्सिस को बदलने के लिए सिलेक्ट करें ।
        नोट: एकल कोशिकाओं (सिंगल्स) के लिए यह द्वार और डबल्स या बड़े समुच्चय(चित्रा 3B)को शामिल नहीं करता है। चूंकि एकल कोशिकाओं में आनुपातिक चौड़ाई और लंबाई होती है, इसलिए उन्हें विकर्ण पर आबादी के रूप में दर्शाया जाना चाहिए। इस विकर्ण द्वार के बाहर आने वाली कोशिकाएं डबल्स या बड़े समुच्चय हैं।
      6. परिगलित (पीआई-पॉजिटिव), अर्ली एपोटोटिक (एनेक्सटिन वी-पॉजिटिव, पीआई-निगेटिव) और लेट एपोटोटिक (एनेक्सटिन वी-पॉजिटिव, पीआई-निगेटिव) कोशिकाओं(चित्रा 3सी)का विश्लेषण करने के लिए गेट पर डबल क्लिक करें।
      7. एक्स-एक्सिस को एनेक्सिन वी और वाई-एक्सिस को पीआई के रूप में लेबल करें।
        नोट: कुछ मामलों में, जहां संकेत तीव्रता कम है, सेल आबादी पृष्ठभूमि के लिए सुधार का एक परिणाम के रूप में नकारात्मक फ्लोरेसेंस मूल्यों के लिए प्रकट हो सकता है । इस मामले में, द्वि-घातीय परिवर्तन करने की सिफारिश की जाती है। ऐसा करने के लिए, वाई-एक्सिस के बगल में टी पर क्लिक करें और कस्टमाइज़ एक्सिसचुनें। नई विंडो में स्केल को द्वि-एक्सपोनेंशियल (बीईएक्स) में बदलते हैं, चौड़ाई के आधार में वृद्धि करके कुल्हाड़ियों में नकारात्मक मूल्य जोड़ते हैं और लागू होते हैं क्लिक करते हैं। इससे सिग्नल की तीव्रता कम होने से घटनाओं के समाधान में सुधार होगा।
      8. डेटा को काउंट प्लॉट के रूप में दिखाएं। एक्स-एक्सिस के ठीक नीचे ऑप्शन टैब का इस्तेमाल करें और मेन्यू से काउंटर प्लॉट का चयन करें।
      9. 4 असतत लक्ष्य आबादी को परिभाषित करने के लिए साजिश पर एक Quat गेट ड्रा।
      10. लेआउट संपादक में क्लिक करके और प्रत्येक अलग क्षेत्र में आबादी खींचें द्वारा, लेआउट संपादक खोलने के लिए खिड़की के शीर्ष पर क्लिक करें।
      11. लेआउट संपादक खिड़की में कार्यक्षेत्र से आबादी को खींचकर और गिराकर लेआउट संपादक में भूखंड रखें।
    3. हिस्टोग्राम का उपयोग करके कल्पना करना
      1. ऑप्शंस टैब से हिस्टोग्राम चुनें।
      2. एनेक्सटिन वी-पॉजिटिव कोशिकाओं का चयन करने के लिए एक गेट लागू करें; वैकल्पिक रूप से, बिसेक्टर उपकरण का उपयोग करके सकारात्मक और नकारात्मक आबादी को परिभाषित किया जा सकता है। नमूना अनुभाग को अब विभिन्न आबादी दिखानी होगी जो रूप में रही हैं और उनके पदानुक्रम हैं।
      3. नमूनों की तुलना करने के लिए, सभी हिस्टोग्राम को एक दूसरे के ऊपर खींचें; हिस्टोग्राम पर राइट क्लिक करें और हिस्टोग्राम से स्टैगर ऑफसेटचुनें ।
    4. सांख्यिकीय विश्लेषण जोड़ें
      1. ब्याज की आबादी पर डबल क्लिक करके सांख्यिकीय टैब खोलें। आवेदन करने के लिए समारोह का चयन करें और शामिल पैरामीटर।
      2. जनसंख्या के नाम में सिग्मा आइकन को खींचकर अन्य आबादी के साथ दोहराएं।
      3. ब्याज के नमूने से गेटिंग रणनीति का चयन करके और इसे ब्याज के मार्कर द्वारा परिभाषित समूह में खींचकर सभी नमूनों पर विश्लेषण लागू करें, उदाहरण के लिए एनेक्सटिन वी।
      4. एफएमओ नियंत्रण नमूनों में गेट्स बनाएं और नकारात्मक और सकारात्मक आबादी को परिभाषित करें; इस गेटिंग रणनीति को पूरे प्रयोग(चित्रा 3D\u2012F)पर लागू किया जाएगा।
        नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक नमूने की व्यक्तिगत रूप से जांच करें कि गेटिंग सही है और जहां आवश्यक हो, संशोधित करें।
      5. यदि कोशिकाओं को मार्कर एंटीबॉडी (जैसे, सीडी 45) के साथ दाग दिया गया है तो तदनुसार इसी एफएमओ और गेट का उपयोग करें।
      6. लेआउट निर्यात करने के लिए फाइल | पर क्लिक करें निर्यात छवि | फाइल फॉर्मेट (जैसे, जेपीजी, पीडीएफ) का चयन करें।
      7. टेबल के अंतिम संस्करण के साथ एक विंडो खोलने के लिए टेबल बनाएं पर क्लिक करें।
      8. फाइल | का चयन करके तालिका का निर्यात करें | के रूप में बचाओ फाइलनेम।

Representative Results

सर्जिकल प्रक्रिया
छाती रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन की सफलता कई मापदंडों के आकलन से निर्धारित होती है, जिनमें से सबसे स्पष्ट हिंडलिब पक्षाघात है। जानवर केवल अपने अग्रअंगों का उपयोग करके चलता है, अपने हिंडलिंबों को खींचता है। अन्यथा गतिविधि का स्तर, जिसमें भोजन, सौंदर्य और सतर्कता शामिल हैं, आम तौर पर सामान्य होते हैं। इसके अलावा, जानवरों को इच्छात्मक मूत्राशय नियंत्रण खो देते हैं जिसके परिणामस्वरूप जांचकर्ता द्वारा हर 12 घंटे में मैनुअल मूत्राशय अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है जब तक कि चोट के बाद 10 से 14 दिनों में रिफ्लेक्स रिटर्न नहीं होता। इच्छामृत्यु के बाद, चोट की सफलता के अतिरिक्त संकेत मुख्य रूप से मूत्राशय से शरीर के वजन अनुपात में वृद्धि से संबंधित हैं, ऊतक रीमॉडलिंग का संकेत है । हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण से यूरोथेलियल और चिकनी मांसपेशी दोनों डिब्बों के भीतर हाइपरप्लासिया का पता चलता है3.

सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी
सार्वजनिक रूप से उपलब्ध अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग करना, बाह्राश मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए मूत्राशय के ऊतकों का संवर्धन निर्धारित किया गया था(चित्रा 2)और पाचन मिश्रण के निर्माण को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया । चूंकि कोलेजन मूत्राशय की दीवार11,12के प्रमुख घटक हैं, इसलिए सबसे पहले हमने माउस एनकोड परियोजना 13 द्वारा उत्पन्न आरएनए प्रोफाइलिंग डेटा सेट का उपयोग करके माउस मूत्राशय में सबसे प्रचुर मात्रा में कोलेजन(एस)निर्धारित करने की मांग की। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि कोलेजन 1A1, कोलेजन 3A1, कोलेजन 1A2 और कोलेजन 6A1 माउस मूत्राशय(चित्रा 2A)के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में कोलेजन प्रकार हैं । हमने कोलेजन 1,3, 6 और हायलुरोनन के एमआरएनए अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए तबला मुरिस (माउस (मस मस्कुलस)) 8 से एकल सेल ट्रांसक्रिप्टोम डेटा का एक संग्रह भी इस्तेमाल किया। डेटा ऊतकों के बीच साझा सेल प्रकार में जीन अभिव्यक्ति की प्रत्यक्ष और नियंत्रित तुलना के लिए अनुमति देते हैं । इस विश्लेषण से पता चला है कि इन बाह अलौकिक मैट्रिक्स घटकों की अभिव्यक्ति यूरिथेलियम(चित्रा 2B)के बजाय मेसेंचिमल सेल प्रकारों में अधिक प्रचलित है।

मूत्राशय से अलग कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर वियोजन का प्रभाव
फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण ने दिखाया कि 4 अलग-अलग प्रोटोकॉल का उपयोग करके एंजाइमेटिक पाचन में क्रमशः 83%, 86%, 93% या 90% की व्यवहार्यता मिली। इस प्रकार, प्रोटोकॉल धारा 3 को सेल व्यवहार्यता के संरक्षण के लिए सबसे मूल्यवान माना जाता था। हमने यह भी देखा कि लगभग 4% कोशिकाएं गल (पीआई+/एनेक्सटिनवी-)(चित्रा 4A)थीं । ये टिप्पणियां पाचन प्रोटोकॉल की दक्षता और कोशिका व्यवहार्यता पर आगामी लाभ पर जोर देती हैं।

मूत्राशय में कोशिकाओं की विभिन्न आबादी पर रीढ़ की हड्डी की चोट का प्रभाव
हमने नियंत्रण की तुलना में एससीआई चूहों के मूत्राशय में कुल सेल संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि देखी। एससीआई मूत्राशय से प्राप्त डॉट भूखंडों का पैटर्न रीढ़ की हड्डी की चोट(चित्रा 4B:पहला कॉलम) के कारण चल रहे अंग रीमॉडलिंग के अनुरूप थोड़ा अलग था। नियंत्रण की तुलना में, एससीआई जानवरों से मूत्राशय CD45-सकारात्मक कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण वृद्धि प्रदर्शित की ।

Figure 1
चित्रा 1: जिगर के हल्के रंग के साथ प्रतिनिधि पर्फ्यूजन पूरा। (क)परफ्यूजन की शुरुआत में लिवर के रंग को दर्शाता है। (ख)परफ्यूजन के अंत में हल्का लिवर का रंग दिखाता है। माउस में माउस में रीढ़ की हड्डी का ट्रांसेक्शन दो सप्ताह पहले था जिसके परिणामस्वरूप मूत्राशय हाइपरट्रॉफी और उसके फलाव से बाहर निकलना (बी) में माउस के विपरीत है जिसमें रीढ़ की हड्डी की चोट नहीं थी; इस मामले में मूत्राशय छोटा है और श्रोणि में छिपा हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: माउस मूत्राशय में बाह्त हथियार मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों की ट्रांसक्रिप्टोमिक अभिव्यक्ति। (A)43 अलग-अलग कोलेजन प्रकारों का बार चार्ट। अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्ट के प्रति किलोबेस पढ़ता द्वारा कहा गया है, प्रति मिलियन मैप रीड्स (RPKM) (डेटा BioProject से एकत्र किया जाता है: PRJNA66167)14। (ख)माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट आधारित 3'-अंत गिनती से प्राप्त सेल प्रकारों में जीन अभिव्यक्ति के वायलिन भूखंड पुरुष और महिला अलग मूत्राशय के नमूनों (पुरुष और महिलाओं) के एक पूल में गिनती । प्रत्येक कोशिका के लिए 1 + काउंट प्रति मिलियन एलएन (सीपीएम + 1)8के प्राकृतिक लॉगरिथम का उपयोग करके लॉग-सामान्यीकृत किया गया था। लोगाें को लेने से पहले 1 सीपीएम का छद्म काउंट जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरेसेंस प्रसार का निर्धारण करने के लिए गेटिंग रणनीति और एफएमओ नियंत्रण। {सेल जनसंख्या का चयन। (ख)सिंगल्स के लिए गेटिंग स्ट्रैटजी । (ग)पीआई और एनेक्सटिन वी एंटीबॉडी का उपयोग करके परिगलित, और जल्दी और देर से एपोटोटिक कोशिकाओं के लिए गेटिंग । (D\u2012F) मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री (जैसे, एंटीबॉडी ए, बी, सी, डी फ्लोरोक्रोम + (एनेक्सटिन वी और पीआई) के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी का एक योजनाबद्ध डॉट प्लॉट। यह फ्लोरोक्रोम एक अन दाग नियंत्रण की तुलना में एफएमओ नियंत्रण द्वारा दिखाए गए चैनल फ्लोरोक्रोम के साथ एंटीबॉडी में फैलता है। नारंगी बिंदीदार रेखा लाल रंग में अन दाग सीमा की तुलना में एफएमओ गेटिंग सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मूत्राशय में विभिन्न कोशिका प्रकारों का फ्लो साइटोमेट्री। (A)एनेक्सटिन वी/पीआई डबल स्टेनिंग फ्लो चार्ट । प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले एंजाइमों और रासायनिक के विभिन्न संयोजनों को संबंधित व्यवहार्यता साजिश के सामने दर्शाया जाता है। ये डेटा प्रदर्शित करता है उच्चतम व्यवहार्यता प्रोटोकॉल धारा 3 के साथ प्राप्त किया गया था। (ख)एकल चैनलों में पाए गए Ly-6A/E (Sca-1) और सीडी 326 (Ep-CAM) की तीव्रता को दर्शाते हुए प्रतिनिधि हिस्टोग्राम । (ग)माउस मूत्राशय की कोशिका आबादी पर एससीआई का प्रभाव। ऊपरी पैनल नियंत्रण गैर सर्जिकल चूहों और निचले पैनल से प्राप्त तीन अलग मूत्राशय पर धुंधला के परिणाम से पता चलता है SCI के साथ तीन जानवरों पर धुंधला के परिणाम से पता चलता है । पहला कॉलम कुल सेल आबादी है। दूसरा कॉलम सिंगलेट गेटिंग सेलेक्शन दिखाता है। तीसरा कॉलम लाइव कोशिकाओं की उपआबादी को दर्शाता है जो बी-कोशिकाओं, टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के लिए नकारात्मक हैं । चौथा कॉलम सीडी 45 के लिए सकारात्मक लाइव कोशिकाओं के लिए धुंधला दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

घटक राशि (500 एमएल के लिए) मोलेरिटी
नैक 4.091 ग्राम 140 एमएमएम
केसीएल 0.186 ग्राम 5 एमएमएम
एमजीसीएल2 0.0476 ग्राम 1 mm
डी ग्लूकोज 0.9 ग्राम 10 mm
हेपेस 1.19 ग्राम 10 mm

तालिका 1: टायरोड के समाधान की तैयारी के लिए घटक। संकेत घटक 500 एमएल टायरोड के समाधान की तैयारी के लिए हैं।

घटक कुल धनराशि प्रोटोकॉल धारा 1 प्रोटोकॉल धारा 2 प्रोटोकॉल धारा 3 प्रोटोकॉल धारा 4
बीएसए 5 मिलीग्राम हाँ हाँ हाँ हाँ
सीएसीएल2 0.03 mM हाँ हाँ हाँ हाँ
कोलेजनस टाइप I 132.5 यूनिट हाँ हाँ हाँ हाँ
कोलेजनेज टाइप III 96.4 यूनिट हाँ हाँ हाँ हाँ
कोलेजनेज टाइप VI 50 यूनिट - - हाँ -
DNase 10 यूनिट हाँ हाँ हाँ -
पपिन 115 यूनिट - - हाँ हाँ
पैन कोलेजनेज 50 यूनिट - - हाँ हाँ
हायलुरोनिडेस 10.5 यूनिट - - हाँ हाँ
डिपासे II 1.25 यूनिट हाँ हाँ - -
सेल वियोजन समाधान 1 एमएल हाँ - हाँ -
रीकॉम्बिनेंट एंजाइम 1 एमएल - हाँ - हाँ

तालिका 2: पाचन बफर की तैयारी के लिए घटक। संकेतित घटक 2.5 एमएल पाचन मिश्रण की तैयारी के लिए हैं (1 यू 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रति मिनट 1 माइक्रोमोल एक सब्सट्रेट के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है। प्रत्येक एंजाइम की इकाई की परिभाषा के लिए उत्पाद डेटा शीट को देखें।)

Discussion

यहां वर्णित माउस स्पाइनल कॉर्ड इंजरी मॉडल मूत्राशय संकुचन और बाहरी मूत्रमार्ग स्फिंकर विश्राम के बीच समन्वय की हानि के कारण एक कार्यात्मक मूत्राशय आउटलेट बाधा बनाने के लिए एक प्रजनन विधि प्रदान करता है। यह बदले में मूत्राशय की दीवार के गहन रीमॉडलिंग उदाहरण भी देते हैं के रूप में जल्दी के रूप में 2 सप्ताह के रूप में चोट के बाद यूरोथेलियल और चिकनी मांसपेशी डिब्बों के विस्तार की विशेषता । कृंतक में एससीआई मॉडल के कार्यान्वयन में महत्वपूर्ण कदमों में रीढ़ की हड्डी के सदमे की अवधि के दौरान मैनुअल मूत्राशय अभिव्यक्ति पर कठोर ध्यान शामिल है जो चोट के बाद 10\u201214 दिनों के लिए लागू होता है; (ii) वजन घटाने को कम करने के लिए पोषण संवर्धन; और (iii) विशेष रूप से उन प्रयोगों के लिए मूत्र स्केलिंग की क्षमता का शमन जो रिफ्लेक्सिंग की वापसी से परे है। मॉडल की सीमाओं में क्षणिक हेमेटुरिया की अवधि के दौरान रक्त के थक्के से चूहों में मूत्रमार्ग ऑक्सीकरण की क्षमता शामिल है, और इसके अतिरिक्त सर्जरी के बाद प्रतिगामी स्खलन के बाद वीर्य कोआगुलम से पुरुष चूहों में।

ऊतक वियोजन दृष्टिकोण यहां वर्णित ऊतकों में संरचनात्मक परिवर्तन है कि प्रयोगात्मक अपमान से उत्पन्न पर विचार करने के महत्व को दिखाता है, इस मामले में महत्वपूर्ण ऊतक एससीआई के बाद remodeling कि बहाव विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं । एकल कोशिका विश्लेषणों में वृद्धि के साथ यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि जीन अभिव्यक्ति में देखे गए मतभेद केवल वियोजन-प्रेरित क्षोभ का परिणाम नहीं हैं, बल्कि रोग मॉडल के लिए प्रासंगिक अंतर्निहित जैविक परिवर्तनों के वास्तव में प्रतिनिधि हैं। सार्वजनिक रूप से उपलब्ध अभिव्यक्ति डेटा के उपयोग ने हमें पाचन बफ़र्स के निर्माण को संशोधित करने की अनुमति दी ताकि व्यवहार्यता को अधिकतम करते हुए बाह्य मैट्रिक्स के प्रभावी पाचन को सुनिश्चित किया जा सके। भविष्य के अनुप्रयोगों में जिन अतिरिक्त संशोधनों पर विचार किया जा सकता है उनमें ऐक्टिनोमाइसिन डी को शामिल किया गया है, ताकि तत्काल प्रारंभिक जीन के प्रतिलेखन को रोका जा सके जो वियोजन प्रोटोकॉल15के प्रति संवेदनशील हैं।

पहले से ही निलंबन में ऊतक को अलग करने या कोशिकाओं को स्थानांतरित करते समय पाइप्टिंग तकनीक महत्वपूर्ण है। कतरनी बलों से कोशिकाओं को शारीरिक क्षति को कम करने के लिए, सेल पुनर्पिति पन के दौरान धीरे-धीरे और धीरे-धीरे पिपेट करना महत्वपूर्ण है। आम तौर पर चौड़े बोर पिपेट सुझावों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि मानक सुझावों का उपयोग कर रहे हैं, तो कतरनी बलों से बचने के लिए धीरे-धीरे सेल निलंबन करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो अन्यथा कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा। इस प्रोटोकॉल में सेल स्ट्रीपर का उपयोग अपरिहार्य है, हालांकि, सेल एकाग्रता में 20% या उससे अधिक की गिरावट आ सकती है, साथ ही 100 माइक्रोन या उससे अधिक की मात्रा में कमी हो सकती है। हम अनुशंसा करते हैं कि सटीक सेल गणना सुनिश्चित करने के लिए तनाव के बाद सेल एकाग्रता निर्धारित की जाए।

प्रवाह साइटोमेट्री में, एफएमओ नियंत्रण ओवरलैपिंग उत्सर्जन चोटियों से सिग्नल के माध्यम से खून बहने के कारण पृष्ठभूमि का एक उपाय प्रदान करते हैं। वे गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी, या पृष्ठभूमि धुंधला का पैमाना नहीं हैं जो उस चैनल में एंटीबॉडी शामिल होने पर मौजूद हो सकते हैं। गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए खाते में, किसी को उचित आइसोटाइप नियंत्रण शामिल करना होगा; पृष्ठभूमि धुंधला के लिए, किसी को नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने की आवश्यकता है। एक साथ लिया, इन नियंत्रणों सेल आबादी का सटीक माप सुनिश्चित करते हैं ।

Disclosures

हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया गया ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (आर01 DK077195 से आर.M.ए, आर01 DK104641 से आर.M ए और D.R..B) तक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम हेमेटोलॉजी/ऑन्कोलॉजी, बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल, बाल रोग विभाग, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल और दाना-फारबर कैंसर इंस्टीट्यूट के डिवीजन में डॉ स्टुअर्ट ऑर्किन से मूल्यवान इनपुट स्वीकार करते हैं । हम भी तकनीकी सहायता और उपयोगी चर्चाओं के लिए चूहों, मैरी Taglienti और डॉ हबीबुल्लाह Shojaeisaadi (डॉ यांग शी प्रयोगशाला, बाल रोग विभाग, नवजात चिकित्सा विभाग, बाल रोग विभाग, नवजात चिकित्सा के प्रभाग, बोस्टन बच्चों के अस्पताल, हार्वर्ड मेडिकल स्कूल) के बाद ऑपरेटिव देखभाल में केली कोस्टा से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle ETHICON J546
70 μm Cell Strainer Thermofisher 22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA Millipore SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) VWR 89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) VWR 89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified BioLegend 118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 BD Biosciences 564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. RS-5172 ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin Sigma A9647-100G
CaCl2 Sigma 2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. RS-6412 ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue Biorad 1450003
Cell Staining Buffer BioLegend 420201
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Collagenase Type I Worthington Biochemical Corporation LS004196
Collagenase Type III Worthington Biochemical Corporation LS004182
Collagenase, Type 6 Worthington Biochemical Corporation LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) Thermofisher V13241
Dispase II Sigma D4693-1G
DNase Sigma DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril) Bayer Health Care LLC, NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP 2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes Fisher Scientific 352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes Fisher Scientific 352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified BioLegend 122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II Sigma H2126
MACS SmartStrainers (100 µm) Miltenyi Biotec, Inc. 130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. RS-5630 ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam Patterson Veterinary 07-891-7959
Papain Worthington Biochemical Corporation LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified BioLegend 115509 Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified BioLegend 100309 Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified BioLegend 100409 Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified BioLegend 100709 Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified BioLegend 108715 Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified BioLegend 116209 Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 BD Biosciences 553141
RBC Lysis Buffer (10X) BioLegend 420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x Biolegend 420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml VWR 89004-290
TC20 Automated Cell Counter Biorad 1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) Patterson Veterinary 07-893-7216 skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red Thermofisher A1217701
Vetropolycin eye ointment Dechra Veterinary Products NADA # 065-016. Approved by FDA. protect eyes during anesthesia

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References

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जीव विज्ञान अंक 160 रीढ़ की हड्डी चोट एकल कोशिका वियोजन प्रवाह साइटोमेट्री मुरीन
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