Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Summary

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Abstract

A coioamnionite é um precipitante comum do nascimento prematuro e está associada a muitas das morbidades da prematuridade, incluindo enterocolite necrosante (NEC). No entanto, ainda não foi descoberto um elo mecanicista entre essas duas condições. Adotamos um modelo murino de coioamnionite envolvendo lipopolisacarídeo (LPS) induzido exposição fetal à inflamação materna (FEMI). Este modelo de FEMI induz uma cascata inflamatória materna, placentária e fetal estéril, que também está presente em muitos casos de coioamnionite clínica. Embora existam modelos que utilizem bactérias vivas e imitem com mais precisão a fisiopatologia de uma infecção ascendente que resulta em coioamnionite, esses métodos podem causar efeitos indiretos no desenvolvimento do insorudo do trato intestinal imaturo e do microbioma em desenvolvimento associado. Usando este protocolo, demonstramos que o FEMI induzido pelo LPS resulta em um aumento dependente de dose na perda de gravidez e nascimento prematuro, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal na prole. Além disso, demonstramos que o FEMI aumenta significativamente a lesão intestinal e citocinas séricas na prole, ao mesmo tempo em que diminui as células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. Embora um modelo semelhante de FEMI induzido pelo LPS tenha sido usado para modelar a associação entre corioamnionite e anormalidades subsequentes do sistema nervoso central, pelo que sabemos, este protocolo é o primeiro a tentar elucidar um elo mecanicista entre a coioamnionite e posterior perturbações no desenvolvimento intestinal como um potencial elo entre a coioamnionite e a NEC.

Introduction

As membranas coriônicas desempenham um papel integral na gravidez dos mamíferos. Eles incluem o acorde e amnion, que servem múltiplas funções. Cercam e protegem o feto, facilitam a sinalização paracrina entre os compartimentos materno e fetal¹, e criam laços de feedback locais dentro das membranas coriônicas, que podem estar envolvidas no início da parturição¹. A compreensão atual das membranas indica que o amnion fornece função de barreira estrutural, e o acorde fornece um tampão imunológico principalmente para proteger o feto em desenvolvimento do sistema imunológico materno². A inflamação dessas membranas é conhecida como coioamnionite. Historicamente, o diagnóstico de coioamnionite clínica foi feito após a presença de febre materna mais um ou mais achados clínicos fetais ou maternos^3,4. No entanto, embora essa definição seja clinicamente útil, sua falta de precisão tornou a pesquisa de coioamnionite desafiadora. Em 2015, na tentativa de esclarecer o diagnóstico, uma oficina de painéis de especialistas do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver definiu a coioamnionite como inflamação intrauterina, ou infecção, ou ambos (triplo I)³. Esse esclarecimento é importante porque, embora a infecção induzida por microbiano seja uma importante causa de inflamação uterina/amniótica, ocorre menos comumente do que a inflamação uterina/amniótica estéril^5,6,7. No geral, a coioamnionite continua sendo um problema significativo de saúde pública, como é visto em 2\u20124% dos partos a termo e 25\u201230% das entregas pré-termo^8,9.

A coioamnionite pode ter efeitos significativos no feto e no recém-nascido. Tem sido bem documentado na literatura que a coioamnionite está associada ao aumento do risco de muitas das morbidades da prematuridade, incluindo displasia broncopulmonar¹⁰, lesão de matéria branca cerebral^11,hemorragia intraventricular¹², retinopatia da prematuridade¹³, e tanto suspeita e confirmada início precoce da sepse neonatal^14,15. Como estamos interessados em mecanismos de lesão e reparação do trato intestinal imaturo, é importante notar que a coioamnionite também está associada ao desenvolvimento posterior da enterocolite necrosante (NEC)^15,16. A NEC é uma doença gastrointestinal devastadora de bebês prematuros que resulta em uma resposta desregulada do hospedeiro à inflamação e necrose intestinal subsequente¹⁷. A cada ano, a NEC afeta mais de 4.000 bebês nos Estados Unidos, e até um terço desses bebês morrem pela doença¹⁸. A patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana^19,culminando em uma via comum final de necrose intestinal. É importante ressaltar que o início da NEC ocorre muitas vezes semanas após o nascimento e exposição potencial à coioamnionite, tornando incerto o vínculo mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC²⁰. Um mecanismo potencial pelo qual a coioamnionite pode contribuir para a fisiopatologia da NEC é através da regulação do sistema imunológico materno, produzindo posteriormente uma forte resposta inflamatória fetal que pode interromper os padrões normais de desenvolvimento fetal^21,22,23.

Múltiplos modelos mamíferos de coioamnionite existem em roedores e ovelhas^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. No entanto, existem poucos dados relativos ao desenvolvimento do trato intestinal além do período inicial do recém-nascido após a exposição fetal induzida pela coioamnionite à inflamação materna (FEMI). A fim de explorar a relação entre FEMI e o desenvolvimento subsequente da lesão do trato intestinal imaturo, adaptamos o modelo FEMI induzido por lipopolissacarídeo (LPS). Lipopolisacarídeos são um componente importante da superfície extracelular em bactérias gram negativas e são um potente estimulante do sistema imunológico inato de múltiplas espécies eucarióticas, incluindo humanos³³. A injeção de LPS materno resulta em uma cascata inflamatória estéril sem os efeitos confusos das bactérias vivas, sendo um modelo bem estabelecido para a indução do nascimento pré-parto³⁴, bem como um modelo de corioamnionite aguda e a síndrome de resposta inflamatória fetal (FIRS), que é a forma mais grave de coioamnionite^24,35. Também foi demonstrado induzir tanto a lesão de matéria branca e cinza cerebral em um modelo de ovelha³⁶ como um modelo murino^37,38,39,40. No entanto, pelo que sabemos, somos os primeiros a utilizar esse modelo de coioamnionite e FEMI para investigar seus efeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal após o nascimento, bem como para investigar uma possível ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC^41,42.

Protocol

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (Protocol #8041401). Todos os animais foram alojados em uma Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados De Animais laboratoriais (AALAC) aprovada na Universidade de Iowa. Todos os ratos eram do tipo selvagem C57Bl/6J. 1. Estabelecimento de FEMI em camundongos gestantes Preparação do LPS Use LPS derivado de Escherichia coli O55:B…

Representative Results

A exposição ao FEMI no dia 15 embrionário leva a uma perda dependente de dose da gravidez e uma taxa dependente de dose de trabalho de parto prematuro(Figura 1)42. Para os experimentos, optou-se por usar uma dose de LPS de 100 μg/kg para minimizar a perda e a prematuridade da gravidez (perda de 50% entre prematuridade e morte fetal intrauterina) enquanto expunimos os fetos a um insulto inflamatório significativo. Usando esta abordagem,…

Discussion

A coioamnionite impacta 2\u20124% do prazo e 25\u201230% das entregas pré-termo^8,9. No entanto, o impacto da coioamnionite pode se estender muito além do nascimento, pois tem se mostrado ter efeitos significativos sobre o feto e o recém-nascido^{10,11,12,13,14,15}<sup…

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056