Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Summary

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis ist ein häufiges Ausfällmittel der Frühgeburt und ist mit vielen der Morbiditäten der Frühreife verbunden, einschließlich nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Eine mechanistische Verbindung zwischen diesen beiden Bedingungen muss jedoch noch entdeckt werden. Wir haben ein murines Modell der Chorioamnionitis mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte fetale Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) angenommen. Dieses Modell von FEMI induziert eine sterile mütterliche, Plazenta und fetale entzündliche Kaskade, die auch in vielen Fällen der klinischen Chorioamnionitis vorhanden ist. Obwohl Es Modelle gibt, die lebende Bakterien nutzen und die Pathophysiologie einer aufsteigenden Infektion, die zu Einer Chorioamnionitis führt, genauer imitieren, können diese Methoden indirekte Auswirkungen auf die Entwicklung des unreifen Darmtraktes und das damit verbundene entwickelnde Mikrobiom verursachen. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass LPS-induzierte FEMI zu einer dosisabhängigen Zunahme des Schwangerschaftsverlusts und der Frühgeburt sowie zu einer Störung der normalen Darmentwicklung bei Nachkommen führt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass FEMI darmverletzungen und Serumzytokine bei Nachkommen signifikant erhöht und gleichzeitig Die Kelch- und Panethzellen verringert, die beide eine erste Reihe angeborener Immunität gegen Darmentzündungen bieten. Obwohl ein ähnliches Modell der LPS-induzierten FEMI verwendet wurde, um die Assoziation zwischen Chorioamnionitis und nachfolgenden Anomalien des zentralen Nervensystems zu modellieren, ist dieses Protokoll unseres Wissens der erste Versuch, eine mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und späteren Störungen in der Darmentwicklung als potenzielleverbindung zwischen Chorioamnionitis und NEC aufzuklären.

Introduction

Die Chorionmembranen spielen eine wesentliche Rolle bei der Hautschwangerschaft. Dazu gehören die Chorion und Amnion, die mehrere Funktionen erfüllen. Sie umgeben und schützen den Fötus, erleichtern die parakrine Signalisierung zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kompartiment¹und erstellen lokale Rückkopplungsschleifen innerhalb der Chorionmembranen, die an der Initiierung der Parturition¹beteiligt sein können. Das aktuelle Verständnis der Membranen deutet darauf hin, dass das Amnion eine strukturelle Barrierefunktion bietet, und die Chorion bietet einen immunologischen Puffer, der in erster Linie den sich entwickelnden Fötus vor dem mütterlichen Immunsystem schützt². Entzündung dieser Membranen ist bekannt als Chorioamnionitis. Historisch gesehen wurde die Diagnose der klinischen Chorioamnionitis nach dem Vorhandensein von mütterlichem Fieber plus einem oder mehreren fetalen oder mütterlichen klinischen Befunden^3,4gemacht. Obwohl diese Definition klinisch nützlich ist, hat ihre mangelnde Präzision die Chorioamnionitis-Forschung zu einer Herausforderung gemacht. Im Jahr 2015 definierte ein Experten-Panel-Workshop des Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development Chorioamnionitis als intrauterine Entzündung oder Infektion oder beides (Triple I)³. Diese Klärung ist wichtig, weil, während mikrobielle induzierte Infektion ist eine wichtige Ursache für Gebärmutter/Amnion-Entzündung, es tritt seltener als sterile Gebärmutter/Amniotische Entzündung^5,6,7. Insgesamt bleibt die Chorioamnionitis ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit, wie sie in 2-u20124% der Laufzeitlieferungen und 25-u201230% der Frühlieferungen^8,9gesehen wird.

Chorioamnionitis kann signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen haben. Es ist in der Literatur gut dokumentiert, dass Chorioamnionitis mit einem erhöhten Risiko für viele der Morbiditäten der Frühreife verbunden ist, einschließlich bronchopulmonaler Dysplasie¹⁰, zerebrale weiße Materie Verletzung¹¹, intraventrikuläre Blutung¹², Retinopathie der Frühreife¹³, und sowohl vermutet und bestätigt früh einsetzte neonatale Sepsis^14,15. Da wir an Verletzungs- und Reparaturmechanismen des unreifen Darmtraktes interessiert sind, ist es wichtig zu beachten, dass Chorioamnionitis auch mit der späteren Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC)^15,16verbunden ist. NEC ist eine verheerende Magen-Darm-Erkrankung von Frühgeborenen, die zu einer dysregulierten Wirtsreaktion auf Entzündungen und anschließende Darmnekrose¹⁷führt. Jedes Jahr betrifft NEC über 4000 Säuglinge in den Vereinigten Staaten, und bis zu einem Drittel dieser Säuglinge sterben an der Krankheit¹⁸. Die Pathogenese von NEC beinhaltet wahrscheinlich eine Kombination von Darmunreife, Dysregulation des unreifen Immunsystems, Darmentzündung, und bakterielle Translokation¹⁹, die in einem letzten gemeinsamen Weg der Darmnekrose gipfelt. Wichtig ist, dass der Beginn von NEC oft Wochen nach der Geburt und eine mögliche Exposition gegenüber Chorioamnionitis auftritt, was die mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und der anschließenden Entwicklung von NEC unklar^{macht 20}. Ein potenzieller Mechanismus, durch den Chorioamnionitis zur Pathophysiologie von NEC beitragen kann, ist durch Upregulation des mütterlichen Immunsystems, die anschließend eine starke fetale Entzündungsreaktion produziert, die normale fetale Entwicklungsmuster stören kann^21,22,23.

Mehrere Säugetiermodelle der Chorioamnionitis existieren bei Nagetieren und Schafen^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Es liegen jedoch nur wenige Daten über die Entwicklung des Darmtraktes nach der ersten Neugeborenenperiode nach der Chorioamnionitis-induzierten fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) vor. Um den Zusammenhang zwischen FEMI und der anschließenden Entwicklung der Verletzung des unreifen Darmtraktes zu untersuchen, haben wir das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte FEMI-Modell angepasst. Lipopolysaccharide sind ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Oberfläche auf gramnegativen Bakterien und sind ein starkes Stimulans des angeborenen Immunsystems mehrerer eukaryotischer Arten, einschließlich Menschen³³. Die mütterliche LPS-Injektion führt zu einer sterilen entzündlichen Kaskade ohne die verwirrenden Wirkungen lebender Bakterien, und es ist ein etabliertes Modell für die Induktion der Frühgeburt³⁴, sowie ein Modell der akuten Chorioamnionitis und des fetalen Entzündungsreaktionssyndroms (FIRS), das die schwerste Form der Chorioamnionitis^24,35ist. Es hat sich auch gezeigt, dass sowohl zerebrale weiße und graue Materie Verletzung in einem Schaf Modell³⁶ und ein murines Modell^37,38,39,40induzieren. Unserer Kenntnis nach sind wir jedoch die ersten, die dieses Modell der Chorioamnionitis und FEMI verwenden, um seine Auswirkungen auf die Entwicklung des Magen-Darm-Traktes nach der Geburt zu untersuchen und einen möglichen mechanistischen Zusammenhang zwischen Chorioamnionitis und späterer Entwicklung von NEC^41,42zu untersuchen.

Protocol

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa (Protocol #8041401) genehmigt. Alle Tiere wurden in einer Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) zugelassenem Vivarium an der Universität von Iowa untergebracht. Alle Mäuse waren Wildtyp-Stamm C57Bl/6J. 1. Etablierung von FEMI bei trächtigen Mäusen LPS-Vorbereitung Verwenden Sie LPS aus Escherichia coli O55:B5 (Lagerkonze…

Representative Results

Die Exposition gegenüber FEMI am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate der Frühzeitarbeit (Abbildung 1)42. Für die Experimente haben wir uns für eine LPS-Dosis von 100 g/kg entschieden, um Schwangerschaftsverlust und Frühreife (50% Verlust zwischen Frühreife und intrauterinem fetalem Tod) zu minimieren und gleichzeitig die Föten einer signifikanten entzündlichen Beleidigung auszusetzen. …

Discussion

Chorioamnionitis wirkt sich auf 2-u20124% der Laufzeit und 25-u201230% der Frühlieferungen^8,9. Jedoch, die Auswirkungen der Chorioamnionitis kann lange nach der Geburt verlängern, da es gezeigt hat, dass signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen^{10,11,12,13,14,}<sup class="xr…

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056