げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル
Summary
酸素誘導網膜症(OIR)は、未熟児網膜症や糖尿病網膜症の増殖などの虚血性網膜症をモデル化し、新血管疾患の抗血管新生薬の評価における概念実証研究のモデルとして使用することができます。OIRは、定量化できるレチナにおける堅牢で再現性の新生血管化を誘導する。
Abstract
虚血性網膜症に一般的に使用されるモデルの1つは酸素誘発性網膜症(OIR)モデルです。ここでは、OIRモデル誘導の詳細なプロトコルと、マウスとラットの両方における読み出しについて説明します。OIRでは、高酸素(マウス)または高酸素および低酸素(ラット)の交互レベルのいずれかにげっ歯類の子犬を曝露することによって、OIRで新生血管新生が誘導される。これらのモデルの主要な読み出しは、新血管(NV)および無血管(AVA)領域の大きさです。この前臨床インビボモデルは、潜在的な抗血管新生薬の有効性を評価したり、遺伝子操作された動物を用いて、遺伝子新生における特定の遺伝子の役割に対処するために使用することができる。このモデルは、OIR誘導に歪みとベンダー固有の変動があり、実験を設計する際に考慮する必要があります。
Introduction
血管新生眼疾患の背後にある病理を研究し、これらの壊滅的な疾患に対する新しい治療法を開発するために、信頼性と再現性のある実験モデルが必要です。病理学的血管新生は、湿潤加齢黄斑変性症(AMD)の特徴であり、その中でも多くの虚血性網膜症の未熟児網膜症(ROP)、増殖性糖尿病網膜症(PDR)および網膜静脈閉塞(RVO)1、2、3、4の特徴である。ヒトとげっ歯類の両方が血管化された最後の組織の一つであるため、ヒトとげっ歯類のretinaは同様の発達パターンに従う。残管血管系が完全に発達する前に、レティナはヒアルイド血管系から栄養供給を受け取り、その結果、その後、残性血管系が発達し始めると後退する。ヒトでは、生前に血管の血管の発達が完了し、げっ歯類では出生後に血管系の成長が起こる。歯立ちの後に生後に起こる血管の発達は、血管形成2,3を研究する理想的なモデルシステムを提供する。新生児げっ歯類は、第3週目4の終わりまでに完全な血管内の残性が発達するまで徐々に発達する血管性の無脈を有する。新生児マウスの成長血管はプラスチックであり、彼らは過酸素刺激5の間に退行を受ける。
ROPは、1,250 g6,7の出生体重を有する未熟児のほぼ70%に影響を及ぼすので、西洋諸国における小児失明の主な原因である。ROPは、レチナル血管が正常な成長を完了する前に生まれた未熟児に発生する。第1期において、早産は、第II期の後に、発達中の性状性の残管化が低酸素症を引き起こし、新しい異常な血管成長を刺激する血管新生成長因子の発現を誘発する、再発性血管成長を遅らせる。OIRモデルは、ROPおよび他の虚血性網膜症の病態生理学を研究し、新しい薬剤候補2、3、9をテストするために広く使用されているモデルである。眼疾患および非眼疾患に対する潜在的な抗血管新生薬の概念実証研究を行うための再現性のあるモデルとして広く考えられています。2つのげっ歯類モデルすなわち、マウスとラットOIRは、そのモデル誘導および疾患表現型において異なる。ラットモデルはROP表現型をより正確に模倣しますが、マウスモデルは、より堅牢で迅速かつ再現性のあるモデルを提供し、より強く、より迅速に再現性の高いモデルを提供します。マウスモデルでは、NVは中央のレティナに発達する。この病理学的読み出しは、PDR、RVおよび滲出性AMDなどの多くの虚血性網膜症、ならびに癌のような非眼球、血管新生疾患に対する薬理学的有効性研究において重要である。さらに、遺伝的に操作された(トランスジェニックおよびノックアウト)マウスの利用可能性は、マウスOIRモデルをより一般的な選択肢にする。しかし、マウスもラットOIRモデルも、ヒト疾患に典型的な筋線維症を作り出さない。
高酸素濃度が1950年代10年のROPの発展に寄与するという理解は、動物モデルの開発につながった。酸素が残性血管系に及ぼす影響に関する最初の研究は1950年12年、13年、14年に行われ、1990年代までOIRモデルには多くの改良がありました。1994年のSmithらの研究は、ヒャロイドパシーと網膜症を分離する現在のマウスOIRモデルの標準を設定した。コナーら(2009)によって血管義務と病理学的NVを定量化する方法の広い採用は、その人気をさらに高めた16.このモデルでは、マウスはP7で5日間、75%酸素(O2)に配置され、続いてノルモキシ状態で5日間置かれる。P7からP12までの高酸素症は、心筋の後退に筋脈管を引き起こす。ノルモキシ性状態に戻ると、血管性の無酸素性の無酸素状態になる(図1A)。血管中央部の低酸素刺激により、いくつかの陰部血管が、膜前房2,3と呼ばれる前レチナルNVを形成し、膜前に向かって芽生える。これらの房は未熟で、過透過性です。NV の量は P17 でピークに達し、その後は後退します。レチナは完全に再血管化され、NVはP23 – P25(図2A)2、3によって完全に後退する。
ラットOIRモデル(O2の様々なレベルを用いた)は、80%および40%でO2レベルを変動させることが80%O2定常暴露17の下よりも顕著なNVを引き起こすことを示す1990年代に最初に説明された。その後、O2が過酸化症からサイクルされる断続的な低酸素モデル(50%)が発見された低酸素症(10-12%)に、80/40%O2モデル18よりもさらに多くのNVを引き起こす。50/10%モデルでは、ラットの子犬は24時間50%に曝され、次いで10%O2で24時間が続く。これらのサイクルは、ラットの子犬がノルモキシ状態に戻されるまでP14まで続く(図1B)。ヒトROP患者のように、ラットモデルでは、未熟な心血管叢のために、血管領域がレチナの周辺に発達する(図3)。
どちらのモデルでも、通常は定量化される主なパラメータは、AVAとNVのサイズです。これらのパラメータは通常、内皮細胞が4,16のラベルが付いているレチナルフラットマウントから分析されます。以前は、プレレチナルNVの量は、血管または血管細胞核を数えることによって、内膜の上の膜上の膜に延びることによって、レチナル断面から評価した。このアプローチの主な制限は、AVA を定量化できないことです。
Protocol
ここに記載されているプロトコルは、フィンランドの国家動物倫理委員会(プロトコル番号ESAVI/9520/2020およびESAVI/6421/04.10.07/2017)によって承認されています。 1. 実験動物とマウスOIRモデル誘導 注:例えば、一般的に使用されるC57BL / 6Jマウスを使用して、同じ日に生まれた子犬を得るために、時間交配動物を使用してください。育成ダム、例えば、129株(129…
Representative Results
モデルの主な結果は血管表現型:AAのサイズとNVの量です。マウスOIRモデルでは、血管軟化は中央のレチナ(図2A)で起こり、ラットモデルでは周囲に発症する、すなわちヒトROP22 と同様である(図3A)。これは、マウスが高酸素状態に曝露されると表面血管叢が既に発症しており、一方ラットモデルでは、OIR誘導時の無血管(P0)である。?…
Discussion
疾患表現型の重症度は、マウスおよびラットOIRモデル23の両方における株およびベンダーの両方に依存する。これは、病理の発達に広い遺伝子学的変動があることを示唆している。一般に、色素化したげっ歯類は、アルビノよりも重篤な表現型を発症する。例えば、アルビノBALB/cの血管系の筋血管は、高酸素症後に急速に血管化し、全24でNVを発症しない。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マリアンヌ・カールスバーグ、アン・マリ・ハーパニエミ、パイヴィ・パルタネン、アン・カンクネンの技術サポートに感謝します。この研究は、フィンランドアカデミー、パイビキ、サカリ・ソールバーグ財団、タンペレ結核財団、フィンランド医学財団、ピルカンマー病院地区研究財団、タンペレ大学病院研究基金によって資金提供されました。
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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Cite This Article
Vähätupa, M., Jääskeläinen, N., Cerrada-Gimenez, M., Thapa, R., Järvinen, T., Kalesnykas, G., Uusitalo-Järvinen, H. Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents. J. Vis. Exp. (163), e61482, doi:10.3791/61482 (2020).