Kemirgenlerde İskemik Retina Hastalıkları için Oksijen Kaynaklı Retinopati Modeli
Summary
Oksijen kaynaklı retinopati (OIR), prematürite retinopatisi ve proliferatif diyabetik retinopati gibi iskemik retina hastalıklarını modellemek ve neovasküler hastalıklar için antianjiyojenik ilaçların değerlendirilmesinde kavram kanıtı çalışmaları için bir model görevi görmek için kullanılabilir. OIR, retinada ölçülebilen sağlam ve tekrarlanabilir neovaskülarizasyona neden olur.
Abstract
İskemik retinopatiler için yaygın olarak kullanılan modellerden biri oksijen kaynaklı retinopati (OIR) modelidir. Burada OIR modeli indüksiyonu için ayrıntılı protokolleri ve hem farelerde hem de sıçanlarda okumalarını açıklıyoruz. Retinal neovaskülarizasyon OIR’de kemirgen yavrularını hiperoksi (fareler) veya alternatif hiperoksi ve hipoksi (sıçanlar) seviyelerine maruz kalarak indüklenmiştir. Bu modellerin birincil okumaları retinadaki neovasküler (NV) ve avasküler (AVA) alanların büyüklüğüdür. Bu preklinik in vivo model, potansiyel anti-anjiyojenik ilaçların etkinliğini değerlendirmek veya genetik olarak manipüle edilmiş hayvanlar kullanarak retina anjiogenezinde belirli genlerin rolünü ele almak için kullanılabilir. Model, deneyleri tasarlarken dikkate alınması gereken OIR indüksiyonunda bazı gerilme ve satıcıya özgü varyasyonlara sahiptir.
Introduction
Anjiyojenik göz hastalıklarının arkasındaki patolojiyi incelemek ve bu yıkıcı hastalıklara yeni terapötikler geliştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneysel modellere ihtiyaç vardır. Patolojik anjiogenez, ıslak yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) ve bunların arasında prematürite retinopatisi (ROP), proliferatif diyabetik retinopati (PDR) ve retinal ven tıkanıklığı (RVO)1, 2,3,4gibi birçok iskemik retina hastalığı için ayırt edicidir. İnsan ve kemirgen retinaları benzer bir gelişim modelini izler, çünkü hem insan hem de kemirgen retinası damarlı son dokular arasındadır. Retina vaskülat tamamen gelişmeden önce, retina besin kaynağını hyaloid vaskülürden alır, bu da retinal vaskülat gelişmeye başladığında geriler1,2. İnsanda, retinal vasküler gelişim doğumdan önce tamamlanır, kemirgenlerde ise doğumdan sonra retinal vaskülat büyümesi meydana gelir. Retinal vasküler gelişim kemirgenlerde postnatal olarak gerçekleştiğinden, anjiogenez2,3. Yenidoğan kemirgenler, üçüncü doğum sonrası haftanın sonuna kadar tam vasküler retina gelişimi elde edilene kadar yavaş yavaş gelişen bir avasküler retinaya sahiptir4. Yenidoğan faresinin büyüyen kan damarları plastiktir ve hiperoksi uyaranı sırasında gerileme geçirirler5.
ROP, Doğum ağırlığı 1.250 g6,7’nin altında olan prematüre bebeklerin neredeyse% 70’ini etkilediği için Batı ülkelerinde çocukluk körlüğünün önde gelen nedenidir. ROP, retina damarları normal büyümesini tamamlamadan doğan prematüre bebeklerde görülür. ROP iki aşamada ilerler: Faz I’de, preterm doğum retina vasküler büyümeyi geciktirir, faz II’den sonra, gelişmekte olan retinanın bitmemiş vaskülerleşmesi hipoksiye neden olur, bu da yeni ve anormal kan damar büyümesini uyaran anjiyojenik büyüme faktörlerinin ifade edilmesine neden olur8. OIR modeli, ROP ve diğer iskemik retinopatilerin patofizyolojisini incelemek ve yeni ilaç adaylarını test etmek için yaygın olarak kullanılan bir model olmuştur2,3,9. Oküler ve oküler olmayan hastalıklar için potansiyel antianjiyojenik ilaçlar için kavram kanıtı çalışmaları yapmak için tekrarlanabilir bir model olarak kabul edilir. İki kemirgen modeli, yani fare ve sıçan OIR, model indüksiyonu ve hastalık fenotipinde farklılık gösterir. Sıçan modeli ROP fenotipini daha doğru bir şekilde taklit eder, ancak fare modeli retina neovaskülarizasyonu (NV) için daha sağlam, hızlı ve tekrarlanabilir bir model sağlar. Fare modelinde, NV merkezi retinaya gelişir. Bu patolojik okuma, PDR, RV ve eksüdatif AMD gibi birçok iskemik retinopatinin yanı sıra kanser gibi oküler olmayan, anjiyojenik hastalıklar için farmakolojik etkinlik çalışmalarında önemlidir. Ayrıca, genetik olarak manipüle edilmiş (transgenik ve nakavt) farelerin mevcudiyeti, fare OIR modelini daha popüler bir seçenek haline getirir. Bununla birlikte, ne fare ne de sıçan OIR modeli, insan hastalıklarında tipik olan retina fibrozisi oluşturur.
Yüksek oksijen seviyelerinin 1950’lerde ROP gelişimine katkıda bulunduğunun anlaşılması10,11 hayvan modellerinin gelişmesine yol açmıştır. Oksijenin retinal vaskülür üzerindeki etkisi ile ilgili ilk çalışmalar 195012 , 13,14’te yapılmış ve 1990’lara kadar OIR modelinde birçok iyileştirme yapılmıştır. Smith ve arkadaşları tarafından 1994 yılında yapılan araştırma, hyaloidopatiyi retinopati15’tenayıran mevcut fare OIR modeli için bir standart belirledi. Connor ve ark. (2009) tarafından vazo-yok etme ve patolojik NV’yi ölçme yönteminin geniş bir şekilde benimsenmesi popülaritesini daha da artırdı16. Bu modelde, fareler P7’de 5 gün boyunca% 75 oksijene (O2)yerleştirilir, ardından normoksik koşullarda 5 gün. P7’den P12’ye hiperoksi, retina vaskülatlarının merkezi retinada gerilemesine neden olur. Normoksik durumlara geri döndüğünde, avasküler retina hipoksik hale gelir (Şekil 1A). Avasküler merkezi retinanın hipoksik uyaranları nedeniyle, retina kan damarlarının bir kısmı vitreusa doğru filizlenir ve preretinal tufts2,3olarak adlandırılan preretinal NV oluşturur. Bu tutamlar olgunlaşmamış ve hiperpermezik. NV miktarı P17’de zirveler, daha sonra geriler. Retina tamamen revaskülarizedir ve NV P23 – P25 (Şekil 2A)2,3tarafından tamamen geriletilir.
Sıçan OIR modeli (farklı O2seviyeleri kullanılarak) ilk olarak 1990’larda, değişen O2 seviyelerinin% 80 ve% 40’ta% 80’in altında daha belirgin NV’ye neden olduğunu gösteren açıklanmıştır O2 sürekli maruz kalma17. Daha sonra, O2’nin hiperoksiden (%50) geçtiği aralıklı hipoksi modelinin hipoksiye (%10-12), %80/40 O2 model18’dendaha fazla NV’ye neden olur. % 50/10 modelinde, sıçan yavruları 24 saat boyunca% 50’ye maruz kalır, ardından% 10 O2’de 24saat . Bu döngüler, sıçan yavrularının normoksik koşullara geri döndüğü P14’e kadar devam eder (Şekil 1B). İnsan ROP hastalarında olduğu gibi, sıçan modelinde de avasküler alanlar olgunlaşmamış retinal vasküler pleksus nedeniyle retinanın çevresine gelişir (Şekil 3).
Her iki modelde de, genellikle ölçülen ana parametreler AVA ve NV’nin boyutudur. Bu parametreler tipik olarak endotel hücrelerinin4,16olarak etiketlendiği retina düz montajlarından analiz edilir. Daha önce preretinal NV miktarı, iç sınırlayıcı zarın üzerinde vitreusa kadar uzanan kan damarı veya vasküler hücre çekirdekleri sayılarak retina kesitlerinden değerlendirildi. Bu yaklaşımın en büyük sınırlaması, AVA’ları ölçmenin mümkün olmamasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hastalık fenotipinin şiddeti hem fare hem de sıçan OIR modellerinde hem zorlanmaya hem de satıcıyabağlıdır 23. Bu, patoloji gelişiminde geniş bir genotipik değişkenlik olduğunu göstermektedir. Genel olarak, pigmentli kemirgenler albino olanlardan daha şiddetli fenotip geliştirir. Örneğin, albino BALB /c’nin retinal vaskülatürü hiperoksiden sonra hızla revaskülarize olur ve24’teNV gelişmez. Benzer şekilde, sıçanlarda, pigmentli Kahverengi Norveç …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen ve Anne Kankkunen’e mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Finlandiya Akademisi, Päivikki ve Sakari Sohlberg Vakfı, Tampere Tüberküloz Vakfı, Finlandiya Tıp Vakfı, Pirkanmaa Hastanesi Bölge Araştırma Vakfı ve Tampere Üniversite Hastanesi Araştırma Fonu tarafından finanse edildi.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
