Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere
Summary
Oksygenindusert retinopati (OIR) kan brukes til å modellere iskemiske retinale sykdommer som retinopati av prematuritet og proliferativ diabetisk retinopati og å tjene som modell for konseptbevisstudier i evaluering av antiangiogene legemidler for neovaskulære sykdommer. OIR induserer robust og reproduserbar neovaskularisering i netthinnen som kan kvantifiseres.
Abstract
En av de mest brukte modellene for iskemiske retinopatier er den oksygeninduserte retinopati (OIR)-modellen. Her beskriver vi detaljerte protokoller for OIR-modellen induksjon og dets avlesninger hos både mus og rotter. Retinal neovaskularisering induseres i OIR ved å utsette gnagervalper enten for hyperoksi (mus) eller vekslende nivåer av hyperoksi og hypoksi (rotter). De primære avlesningene av disse modellene er størrelsen på neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i netthinnen. Denne prekliniske in vivo-modellen kan brukes til å evaluere effekten av potensielle anti-angiogene legemidler eller for å ta opp rollen som spesifikke gener i retinal angiogenese ved hjelp av genetisk manipulerte dyr. Modellen har en viss belastning og leverandørspesifikk variasjon i OIR-induksjonen som bør tas i betraktning ved utdesign av eksperimentene.
Introduction
Pålitelige og reproduserbare eksperimentelle modeller er nødvendig for å studere patologien bak angiogene øyesykdommer og for å utvikle nye terapeutiske midler til disse ødeleggende sykdommene. Patologisk angiogenese er kjennetegnet for våt aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og for mange iskemiske retinale sykdommer blant dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal vene okklusjon (RVO)1,2,3,4. Menneskelige og gnager retinas følger et lignende utviklingsmønster, da både menneskelig og gnager retina er blant de siste vevene som er vaskularisert. Før retinal vaskulaturen er fullstendig utviklet, mottar netthinnen sin næringstilførsel fra hyaloid vaskulatur, som igjen går tilbake når retinal vaskulatur begynner å utvikleseg 1,2. Hos mennesker er retinal vaskulær utvikling fullført før fødselen, mens hos gnagere oppstår veksten av retinal vaskulatur etter fødselen. Siden retinal vaskulær utvikling oppstår postnatalt hos gnagere, gir det et ideelt modellsystem for å studere angiogenese2,3. De nyfødte gnagere har en avascular retina som utvikler seg gradvis til fullstendig vaskulær retina utvikling oppnås ved slutten av tredje postnatal uke4. De voksende blodårene av neonatal mus er plast, og de gjennomgår regresjon under hyperoksistimulans5.
ROP er den ledende årsaken til barndommen blindhet i vestlige land, da det påvirker nesten 70% av de premature spedbarn med fødselsvekt under 1250 g6,7. ROP forekommer hos premature spedbarn som er født før retinal fartøy fullfører sin normale vekst. ROP utvikler seg i to faser: i fase I forsinker tidlig fødsel retinal vaskulær vekst der etter i fase II forårsaker den uferdige vaskulariseringen av den utviklende netthinnen hypoksi, noe som induserer uttrykket av angiogene vekstfaktorer som stimulerer ny og unormal blodkarvekst8. OIR-modellen har vært en mye brukt modell for å studere patofysiologien til ROP og andre iskemiske retinopatier, samt å teste nye narkotikakandidater2,3,9. Det er allment ansett som en reproduserbar modell for å utføre proof-of-concept studier for potensielle antiangiogene legemidler for okulære så vel som ikke-okulære sykdommer. De to gnagermodellene, det vil vil at mus og rotte OIR varierer i deres modellinduksjon og sykdomphenotype. Rottemodellen etterligner ROP fenotype mer nøyaktig, men musemodellen gir en mer robust, rask og reproduserbar modell for retinal neovaskularisering (NV). I musemodellen utvikler NV seg til den sentrale netthinnen. Denne patologiske lesing er viktig i farmakologiske effektstudier for mange iskemiske retinopatier, som PDR, RV og eksudativ AMD, samt for ikke-okulære, angiogene sykdommer som kreft. Videre gjør tilgjengeligheten av genetisk manipulerte (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til et mer populært alternativ. Imidlertid skaper verken mus eller rotte OIR-modell retinal fibrose, som er typisk for menneskelige sykdommer.
Forståelsen av at høye oksygennivåer bidrar til utviklingen av ROP i 195010,11 førte til utvikling av dyremodeller. De første studiene om effekten av oksygen på retinal vaskulatur ble gjort i 195012,13,14 og frem til 1990-tallet var det mange forbedringer til OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. i 1994 satt en standard for den nåværende musen OIR modell som skiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred innføring av metoden for å kvantifisere vaso-utslettelse og patologisk NV av Connor et al. (2009) ytterligere økt sin popularitet16. I denne modellen plasseres mus ved 75 % oksygen (O2) i 5 dager ved P7, etterfulgt av 5 dager under normoksiske forhold. Hyperoksi fra P7 til P12 forårsaker retinal vaskulatur til regress i sentral netthinnen. Ved retur til normoksiske forhold blir avascular retina hypoksisk (figur 1A). På grunn av hypoksiske stimuli av den avascular sentrale netthinnen, spirer noen av retinale blodkar mot glasslegemet, danner preretinal NV, kalt preretinal tufts2,3. Disse tuftene er umodne og hyperpermeable. Mengden NV topper på P17, hvor etter som den går tilbake. Netthinnen er helt revaskularisert og NV er fullstendig regressed av P23 – P25 (Figur 2A)2,3.
Rotteoir-modellen (ved bruk av varierende nivåer av O2) ble først beskrevet på 1990-tallet som viser at varierende O2-nivåer ved 80 % og 40 % forårsaker mer uttalt NV enn under 80 % O2 konstant eksponering17. Senere ble det oppdaget at den intermitterende hypoksimodellen, hvor O2 sykles fra hyperoksi (50 %) hypoksi (10-12 %), forårsaker enda mer NV enn 80/40% O2 modell18. I 50/10% modellen blir rottevalper utsatt for 50% i 24 timer, etterfulgt av 24 timer i 10% O2. Disse syklusene fortsetter til P14, når rottevalpene returneres til normoksiske tilstander (figur 1B). Som hos humane ROP-pasienter utvikler de avascular områdene i rottemodellen seg til periferien av netthinnen på grunn av umoden retinal vaskulær plexus (figur 3).
I begge modellene er de viktigste parametrene som vanligvis kvantifiseres, størrelsen på AVA og NV. Disse parametrene analyseres vanligvis fra retinal flate mounts hvor endotelcellene er merket4,16. Tidligere ble mengden preretinal NV evaluert fra retinale tverrsnitt ved å telle blodkar eller vaskulære cellekjerner som strekker seg til glasslegemer over den indre begrensende membranen. Den store begrensningen av denne tilnærmingen er at det ikke er mulig å kvantifisere AVAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alvorlighetsgraden av sykdom fenotype er avhengig av både belastningen og til og med leverandør i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på at det er en bred genotypisk variasjon i patologiutviklingen. Generelt utvikler pigmenterte gnagere mer alvorlig fenotype enn albinoene. For eksempel, retinal vaskulatur av albino BALB / c revaskulariserer raskt etter hyperoksi og utvikler ikke NV i det hele tatt24. På samme måte, hos rotter, viser pigmenterte Brown Norway …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for utmerket teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
References
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
