श्वान सेल फेनोटाइप विनिर्देश का मूल्यांकन करने के लिए ट्यूनेबल एक्सपेरिुलर मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरमेंट्स की तैयारी
Summary
इस पद्धति का उद्देश्य उस तंत्र को चित्रित करना है जिसके द्वारा एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स संकेत जैसे सब्सट्रेट कठोरता, प्रोटीन संरचना और सेल आकृति विज्ञान श्वान सेल (एससी) फेनोटाइप को विनियमित करते हैं।
Abstract
दर्दनाक परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) चोटों वर्तमान में पूर्ण कार्यात्मक वसूली हासिल करने के लिए उपयुक्त उपचार की कमी है । श्वान कोशिकाएं (एससी), पीएनएस की प्रमुख ग्लियल कोशिकाओं के रूप में, चोट के बाद एक पुनर्योजी सेल फेनोटाइप में अलग-अलग द्वारा पीएनएस पुनर्जनन को बढ़ावा देने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। हालांकि, अनुसूचित जाति की अलग राज्य पुनर्जनन के लिए आवश्यक समय अवधि के माध्यम से बनाए रखने के लिए चुनौतीपूर्ण है और आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में परिवर्तन से प्रभावित है। इसलिए, अनुसूचित जाति के बीच जटिल परस्पर क्रिया का निर्धारण करना और अनुसूचित जाति की पुनर्योजी क्षमता के संकेत प्रदान करने के लिए अलग ईसीएम आवश्यक है । इसके समाधान के लिए, एक रणनीति बनाई गई थी जहां विभिन्न ईसीएम प्रोटीन को एक ट्यून करने योग्य पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) सब्सट्रेट पर सोख दिया गया था जिसने एक मंच प्रदान किया जहां कठोरता और प्रोटीन संरचना को संग्राहक किया जा सकता है। अनुसूचित जाति को ट्यूनेबल सब्सट्रेट्स पर वरीयता दी गई थी और एससी फेनोटाइप की गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करने वाले महत्वपूर्ण सेलुलर कार्यों को मापा गया था। अनुसूचित जाति प्रोटीन अभिव्यक्ति और सेलुलर आकृति विज्ञान के बीच परस्पर क्रिया को समझाने के लिए, व्यक्तिगत माइक्रोकॉन्टैक्ट मुद्रित सेलुलर पैटर्न के अलावा अनुसूचित जाति के अलग-अलग सीडिंग घनत्व का उपयोग किया गया था और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला और पश्चिमी दाग की विशेषता थी। परिणामों से पता चला है कि एक छोटे प्रसार क्षेत्र और सेलुलर विस्तार की उच्च सीमा के साथ कोशिकाओं अनुसूचित जाति पुनर्योजी फेनोटाइपिक मार्कर के उच्च स्तर को बढ़ावा दिया । यह पद्धति न केवल अनुसूचित जाति के ईसीएम और सेलुलर फ़ंक्शन के बीच महत्वपूर्ण संबंधों को सुलझाना शुरू करती है, बल्कि परिधीय तंत्रिका मरम्मत में बायोमैटेरियल्स के भविष्य के अनुकूलन के लिए दिशानिर्देश भी प्रदान करती है।
Introduction
परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) चोटों रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता से समझौता और सामाजिक आर्थिक कारकों की एक भीड़ के माध्यम से एक महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा करके स्वास्थ्य देखभाल में एक प्रमुख नैदानिक चुनौती बनी हुई है1,,2 ,2। श्वान कोशिकाएं (एससी), पीएनएस में प्रमुख ग्लियल कोशिकाओं के रूप में, पीएनएस पुनर्जनन और कम अंतर चोटों में कार्यात्मक वसूली में सहायता के लिए आवश्यक आणविक और शारीरिक संकेत प्रदान करती हैं। यह अनुसूचित जाति की उल्लेखनीय क्षमता के कारण एक myelinating या Remak फेनोटाइप3से एक “मरम्मत” सेल फेनोटाइप में विवर्तित करने के लिए है । मरम्मत अनुसूचित जाति कई मायनों में एक विशिष्ट सेल फेनोटाइप है। चोट के बाद, अनुसूचित जाति सेल चक्र में फिर से प्रवेश करके अपनी प्रसार दर में वृद्धि और पुनर्नर्वेशन की सुविधा के लिए कई प्रतिलेखन कारकों की अभिव्यक्ति शुरू करते हैं । सी-जून और पी75 एनटीआर जैसे इन कारकों को उपनियमित किया जाता है, जबकि मायलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी) जैसे एससी मार्कर को डाउनरेडिनियमितकिया जाता,5है। इसके अलावा, अनुसूचित जाति के लिए लम्बी हो आकृति विज्ञान बदलने के लिए और एक दूसरे के साथ गठबंधन करने के लिए चोट साइट6भर में Büngner बैंड फार्म । यह अक्षों को सही डिस्टल लक्ष्य तक पहुंचाने के लिए एक भौतिक मार्गदर्शन तंत्र प्रदान करता है7. हालांकि, अनुसूचित जाति के पास कम अंतर चोटों में तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा देने की क्षमता के बावजूद, कार्यात्मक वसूली का परिणाम गंभीर चोटों में खराब रहता है । यह भाग में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) मार्गदर्शन संकेतों के नुकसान के कारण है, साथ ही8समय की लंबी अवधि में पुनर्योजी फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए एससी की असमर्थता है।
तंत्रिका उत्थान और वसूली प्रक्रिया चोट के बाद बेसल लैमिना की स्थिति से परिचित रूप से जुड़ी हुई है। बेसल लैमिना तंत्रिका के चारों ओर ईसीएम की एक परत है जो मार्गदर्शन की सुविधा प्रदान करती है और उन मामलों में एक्सॉन और एससी के लिए ईसीएम-बाध्य संकेत प्रदान करती है जहां यह चोट के बाद बरकरार रहता है9। ईसीएम की स्थिति और कोशिकाओं को मैट्रिक्स बाध्य संकेत देने की क्षमता बेहद महत्वपूर्ण है और पहले विभिन्न संदर्भों10 , 11 , 12,13,,12,14में इसका पता लगाया गया है ।14 उदाहरण के लिए, यह दर्शाया गया है कि ईसीएम की कठोरता प्रसार और भेदभाव11 , 15,,1616जैसे सेल कार्यों का मार्गदर्शन कर सकती है । ईसीएम की संरचना से एक अलग सेलुलर प्रतिक्रिया भी हो सकती है और 17,18,18को इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग पाथवे के माध्यम से माइग्रेशन और भेदभाव जैसे सेल व्यवहारों को विनियमित किया जा सकता है । इसके अलावा, क्षेत्र के प्रसार और सेलुलर विस्तार सहित सेल आकृति विज्ञान, समारोह को विनियमित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं और ईसीएम-बाध्य संकेतों द्वारा शासित किया जा सकता है19,,20। पिछले कई अध्ययनों ने परिभाषित वंशों में अंतर करने वाली स्टेम कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, फिर भी अनुसूचित जाति के पास एक स्वस्थ तंत्रिका के भीतर एक होमओस्टेटिक, वयस्क अनुसूचित जाति से फेनोटाइप को बदलने की समान क्षमता है, जो प्रोटीन और विकास कारकों को स्रावित करने में सक्षम है, जबकि तंत्रिका चोट5,,21के बाद ईसीएम को फिर से तैयार करना। इसलिए, यह विशेष रूप से सहज अनुसूचित जाति पुनर्योजी क्षमता और ईसीएम बाध्य संकेतों के बीच संबंधों को अंतर्निहित तंत्र की पहचान करने के लिए अंतर्दृष्टि के लिए अंततः तंत्रिका उत्थान के लिए इस क्षमता का दोहन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
इसका समाधान करने के लिए, हमने एक सेल कल्चर सब्सट्रेट का उत्पादन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति विकसित की है जहां यांत्रिक कठोरता और लिगांड प्रकार को शारीरिक रूप से प्रासंगिक श्रेणियों में आसानी से ट्यून किया जा सकता है। पॉलीएक्रिलामाइड जेल की तुलना में पॉलीडिमेथाइल सिलोक्सेन (पीडीएमएस) को अपने अत्यधिक ट्यूनेबल यांत्रिकी के कारण एक सब्सट्रेट के रूप में चुना गया था, जहां अधिकतम युवा का मॉड्यूलस लगभग 12 केपीए है जो लगभग 1000 केपीए22,23, 24,24पर पीडीएमएस के विपरीत है।, यह हाथ में काम करने के लिए फायदेमंद है, के रूप में हाल के अध्ययनों से पता चला है एक खरगोश sciatic तंत्रिका के युवा मॉड्यूलस विकास के दौरान ५० kPa से अधिक हो सकता है, जिससे सुझाव है कि PNS के भीतर नसों की कठोरता की सीमा पहले से व्यापक है की जांच की । विभिन्न प्रोटीन अनुसूचित जाति के व्यवहार पर यांत्रिकी और लिगामेंट्स के संयोजन विनियमन का विश्लेषण करने के लिए पीडीएमएस सब्सट्रेट्स पर सोखने में सक्षम हैं। यह पीएनएस पुनर्जनन प्रक्रिया में मौजूद कई सूक्ष्मवाण्यक संकेतों की जांच और काम के लिए उच्च स्तर की ट्यूनिबिलिटी की तुलना पूरी तरह से सब्सट्रेट25की कठोरता पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, ये इंजीनियर सेल कल्चर सब्सट्रेट्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, वेस्टर्न ब्लॉट और क्वांटिटेटिव पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यू-पीसीआर) जैसे मात्रात्मक विश्लेषण विधियों की एक भीड़ के साथ संगत हैं।
यह इंजीनियर सेल कल्चर प्लेटफॉर्म प्रत्येक ईसीएम-बाउंड सिग्नल के व्यक्तिगत ट्यूनेबिलिटी के उच्च स्तर के कारण मशीनी रास्तों का विश्लेषण करने के लिए अत्यधिक उपयुक्त है। इसके अलावा, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग सहित सेल माइक्रोपैटर्निंग के लिए लोकप्रिय तरीकों को सब्सट्रेट्स पर हासिल किया जा सकता है ताकि नियंत्रित सेलुलर आसंजन को अन्य ईसीएम बाउंड संकेतों24के संबंध में सेल आकार का विश्लेषण करने की अनुमति दी जा सके। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि लाइन पैटर्न वाले सबस्ट्रेट्स, जो सेल आबादी में विस्तार को बढ़ावा देते हैं, तंत्रिका उत्थान के दौरान Büngner बैंड के भीतर विस्तारित और पुनर्योजी अनुसूचित जाति की नकल और अध्ययन करने के लिए एक उपकरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा , सेलुलर आकृति विज्ञान कई सेल कार्यों का एक शक्तिशाली नियामक है और26 , 27 को नियंत्रित,नहीं किए जाने पर संभावित रूप से जटिल प्रायोगिक परिणाम पेश करसकताहै । अब ईसीएम संकेतों 28,,29,30द्वारा28विनियमित अनुसूचित जाति पुनर्योजी फेनोटाइप को नियंत्रित करने वाले तंत्रों पर महत्वपूर्ण ध्यान दिया जा रहा है । यह बायोमैटेरियल्स के डिजाइन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आवश्यक है जिसे पीएनएस तंत्रिका उत्थान में सहायता के लिए तंत्रिका मार्गदर्शन नाली के रूप में लागू किया जा सकता है। इन विस्तृत प्रोटोकॉल अंततः ईसीएम बाध्य संकेतों द्वारा विनियमित अनुसूचित जाति और अन्य सेल प्रकार समारोह के तंत्र को समझने के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुसूचित जाति तंत्रिका चोट के बाद अपने फेनोटाइपिक परिवर्तन और पुनर्योजी क्षमता के कारण तंत्रिका उत्थान को बढ़ावा दे सकती है। हालांकि, ईसीएम संकेत इस पुनर्योजी क्षमता को कैसे विनियमित करते हैं, यह ज्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कृतज्ञता सिनसिनाटी विश्वविद्यालय से धन समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी समर्थन के लिए सिनसिनाटी उन्नत सामग्री लक्षण वर्णन प्रयोगशाला के विश्वविद्यालय के रॉन Flenniken शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Texas Red conjugate | Thermo Fisher Scientific | A23017 | BSA staining to show micropatterns |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | Antibody used for western blot analysis |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | Antibody used for western blot analysis |
| BrdU | Thermo Fisher Scientific | B23151 | Reagent used to measure cell proliferation |
| BrdU primary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | B35130 | Used to visualize BrdU in cell proliferation assays |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | Protein used to coat coverslips |
| Compression force test machine | TestResources | Instrument to quantify mechanical properties of polymers | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Cell culture medium supplemental |
| Fibronectin | Thermo Fisher Scientific | 33010-018 | Protein used to coat coverslips |
| Fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti2 | Fluorescence microscope |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78440 | Protease and Phosphatase Inhibitor |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | Protein used to coat coverslips |
| Mounting medium with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36971 | Coverslip mountant and nuclei staining |
| Mouse c-Jun primary antibody | Thermo Fisher Scientific | 711202 | Primary antibody to visualize c-Jun protein |
| Mouse β-Actin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3700S | Loading control for western blot experiments |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Cell culture medium supplemental |
| Photoresist SU 2010 | KAYAKU | SU8-2010 | Photoresist |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P-2443 | Block non-specific protein binding |
| Rabbit c-Jun primary antibody | Cell Signaling Technology | 9165S | Primary antibody for visualization of c-Jun protein |
| Rabbit myelin basic protein primary antibody | Abcam | ab40390 | Primary antibody for visualization of MBP |
| Rabbit p75NTR primary antibody | Cell Signaling Technology | 8238S | Primary antibody for visualization of p75NTR |
| Rhodamine phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | Visualization of cell cytoskeleton |
| RIPA buffer | Abcam | ab156034 | Cell lysis buffer |
| RT4-D6P2T Schwann cell line | ATCC | CRL-2768 | Cell line used in experiments |
| SYLGARD 184 PDMS base and curing agent | Sigma Aldrich | 761036 | Tunable polymer used to coat coverslips |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 15090-046 | Cell dissociation reagent |
| UV-Ozone cleaner | Novascan | Increase hydrophicility of PDMS | |
| Versene (1x) | Thermo Fisher Scientific | 15040066 | Cell dissociation reagent |
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